Studien zu Virulenzeigenschaften typischer und atypischer uropathogener Escherichia coli:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2014
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| Beschreibung: | Zsfassung in dt. und engl. Sprache |
| Beschreibung: | V, 185 S. Ill., graph. Darst. |
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| adam_text | STUDIEN ZU VIRULENZEIGENSCHAFTEN TYPISCHER UND
ATYPISCHER UROPATHOGENER ESCHERICHIA COII
STUDIES ON VIRULENCE PROPERTIES OF TYPICAL AND
ATYPICAL UROPATHOGENIC ESCHERICHIA COLI
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES
NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES
DER GRADUATE SCHOOL OF LIFE SCIENCES (GSLS),
JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET WUERZBURG,
KLASSE INFECTION AND IMMUNITY
VORGELEGT VON
ROSWITHA DOROTHEE SCHILLER
AUS BERLIN
WUERZBURG 2014
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 3
1 EINLEITUNG 5
1.1 DIE SPEZIES ESCHERICHIA COLI 5
1.2 HARNWEGSINFEKTIONEN UND UROPATHOGENE ESCHERICHIA COLI (UPEC) 7
1.2.1 DER UROPATHOGENE E. COLI STAMM 536 12
1.3 BAKTERIELLE FITNESS 14
1.4 DAS AUTOTRANSPORTERADHAESIN ANTIGEN 43 - VIRULENZ- ODER
FITNESSFAKTOR? 16
1.4.1 AUTOTRANSPORTERPROTEINE 17
1.4.2 DIE AIDA-UNTERFAMILIE DER AUTOTRANSPORTERPROTEINE 19
1.4.3 DAS AUTOTRANSPORTERPROTEIN ANTIGEN 43 (AG43) 21
1.4.3.1 POSTTRANSLATIONALE GLYKOSYLIERUNG VON AG43 24
1.5 AUFGABENSTELLUNG UND ZIELSETZUNG 26
2 MATERIALIEN 29
2.1 BAKTERIENSTAEMME 29
2.2 MAEUSE 32
2.3 PLASMIDE 32
2.4 OLIGONUKLEOTIDE 33
2.5 CHEMIKALIEN, ENZYME UND ANTIBIOTIKA 33
2.6 PUFFER UND LOESUNGEN 34
2.7 NAEHRMEDIEN 34
2.8 ANTIKOERPER 37
2.9 MOLEKULARBIOLOGISCHE KITS 38
2.10 GERAETE UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 39
I
INHALTSVERZEICHNIS
3 METHODEN 41
3.1 KULTUR VON BAKTERIEN 41
3.1.1 ANZUCHT UND STAMMHALTUNG 41
3.1.2 BESTIMMUNG DES WACHSTUMS IN FLUESSIGKULTUREN 41
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE UND GENETISCHE METHODEN 41
3.2.1 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS E. COLI 41
3.2.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 42
3.2.2.1 ISOPROPANOL-EXTRAKTION VON PLASMID-DNA 42
3.2.2.2 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION VON PLASMID-DNA 43
3.2.2.3 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA MITTELS KOMMERZIELLEM KIT 43
3.2.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 43
3.2.4 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 44
3.2.5 GELEXTRAKTION 45
3.2.6 DNA-SEQUENZIERUNG 45
3.2.7 ENZYMATISCHE HYDROLYSE VON DNA 46
3.2.8 KLONIERUNG VON DNA 46
3.2.9 HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN 46
3.2.9.1 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIENZELLEN 46
3.2.9.2 HERSTELLUNG CHEMISCH KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN 47
3.2.10 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN 47
3.2.10.1TRANSFORMATION ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIEN 47
3.2.10.2TRANSFORMATION CHEMISCH KOMPETENTER BAKTERIEN (HITZESCHOCK) 47
3.2.11 HERSTELLUNG VON E. COLI DELETIONSMUTANTEN 48
3.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 49
3.3.1 ISOLIERUNG VON PROTEINEN 49
3.3.1.1 GESAMTZELLEXTRAKT 49
3.3.1.2 HITZEEXTRAKTION 49
3.3.1.3 UEBEREXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE 50
3.3.2 PROTEINAUFREINIGUNG 51
3.3.2.1 FAELLUNG MIT TRICHLORESSIGSAEURE 51
3.3.2.2 NICKEL-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE MIT PROTINO NI-TED 2000-SAEULE
51
3.3.2.3 DIALYSE VON PROTEINEN 52
3.3.2.4 AUFKONZENTRIEREN VON PROTEINEN 52
3.3.3 BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN MITTELS ROTI-NANOQUANT 52
3.3.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 53
3.3.5 COOMASSIE-FAERBUNG VON SDS-POLYACRYLAMIDGELEN 54
3.3.6 WESTERN BLOT (IMMUNOBLOT) 54
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.6.1 PROTEINTRANSFER (*SEMIDRY BLOT ) 54
3.3.6.2 IMMUNDETEKTION 55
3.3.7 UNTERSUCHUNGEN ZUM GLYKOSYLIERUNGSSTATUS VON PROTEINEN 56
3.3.7.1 DETEKTION VON GLYKOPROTEINEN MIT HILFE KOMMERZIELLER KITS 56
3.3.7.2 UNTERSUCHUNG MOEGLICHER GLYKOPROTEINE DURCH MASSENSPEKTROMETRIE
57
3.4 PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG VON BAKTERIEN 58
3.4.1 WACHSTUMSKINETIK IN LB-MEDIUM UND URIN 58
3.4.2 UNTERSUCHUNG AUF AUTOAGGREGATION 58
3.4.3 UNTERSUCHUNG AUF BIOFILMBILDUNG 58
3.4.4 MOTILITAETSTEST AUF SCHWAERMAGAR 59
3.4.5 NACHWEIS DES RDAR-MORPHOTYPS (CURLI- UND ZELLULOSEPRODUKTION) 59
3.4.6 NACHWEIS DER ZELLULOSESYNTHESE 59
3.4.7 NACHWEIS DER HAEMOLYSINPRODUKTION 60
3.4.8 NACHWEIS DER TYP 1-FIMBRIEN-EXPRESSION (MANNOSE-ABHAENGIGE
HEFEAGGLUTINATION) 60
3.4.9 UNTERSUCHUNG AUF COLICINPRODUKTION (COLICININHIBITIONS-TEST) 60
3.4.10 UNTERSUCHUNG AUF AEROBAKTINPRODUKTION 60
3.4.11 NACHWEIS DER SIDEROPHORENBILDUNG IN KULTURUEBERSTAENDEN (*CAS
LIQUID ASSAY NACH
SCHWYN UND NEILANDS (1987)) 61
3.5 EXPERIMENTELLES MAUSMODELL DER AUFSTEIGENDEN HARNWEGSINFEKTION 61
3.6 COMPUTERGESTUETZTE ANALYSEN 62
3.7 STATISTISCHE ANALYSE 63
4 ERGEBNISSE 65
4.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR NATUERLICHEN GLYKOSYLIERUNG VON AG43 IN E. COLI
STAMM 536 65
4.1.1 KLONIERUNG, EXPRESSION UND ISOLATION VON REKOMBINANTEM AG43A UND
AG43B 65
4.1.1.1 KLONIERUNG VON REKOMBINANTEM AG43A UND AG43B 65
4.1.1.2 EXPRESSION UND AUFREINIGUNG VON REKOMBINANTEM AG43A UND AG43B 67
4.1.2 UNTERSUCHUNGEN ZUM GLYKOSYLIERUNGSSTATUS VON ISOLIERTEM AG43A UND
AG43B 73
4.1.2.1 ANALYSE MIT HILFE KOMMERZIELLER GLYKOPROTEIN-DETEKTIONSKITS 73
4.1.2.2 MASSENNSPEKTROMETRISCHE UNTERSUCHUNG DES GLYKOSYLIERUNGSSTATUS
DER ISOLIERTEN
AG43-VARIANTEN (NANOELEKTROSPRAY-IONISATIONS-MASSENSPEKTROMETRIE
(NESI-MS)) .77
4.1.3 UEBERPRUEFUNG DER KUENSTLICHEN GLYKOSYLIERUNG VON AG43A IN E. COLI
STAMM 536 DM.. 82
4.1.4 UNTERSUCHUNGEN ZU EXPRESSION UND GLYKOSYLIERUNG VON AIDA-I IN E.
COLI 536 DM,
E. COLI 536 RDM UND E. COLI MG1655 LFLM AEFLU 84
4.2 IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG MOEGLICHER GLYKOSYLTRANSFERASEN
IN E. COLI STAMM
536 89
4.2.1 IDENTIFIZIERUNG PUTATIVER GT-KODIERENDER *OPEN READING FRAMES IN
E. COLI STAMM
536 89
4.2.2 KONSTRUKTION DER GT-DELETIONSMUTANTEN VON E. COLI 536 91
III
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.3 PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER GT-DELETIONSMUTANTEN 92
4.3 VERGLEICHSSTUDIEN ZUM UROPATHOGENEN VIRULENZPOTENTIAL AUSGEWAEHLTER
E. COLI STAEMME
MITTELS DES EXPERIMENTELLEN MAUSMODELLS DER AUFSTEIGENDEN
HARNWEGSINFEKTION (HWI).
103
4.3.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR IN V/VO-VIRULENZ UND -FITNESS VON
OGN4.3-DELETIONSMUTANTEN DES
E. COLI STAMMES 536 103
4.3.1.1 KONSTRUKTION DER
OGA
?43-KOMPLEMENTANTEN 103
4.3.1.2 UNTERSUCHUNG DER IN WVO-VIRULENZ UND -FITNESS DER
OGN43-DELETIONSMUTANTEN UND
KOMPLEMENTIERTEN MUTANTEN 105
4.3.2 UNTERSUCHUNG DER IN WVO-VIRULENZ UND -FITNESS VON
I/WZ-KOMPLEMENTANTEN DES E.
COLI STAMMES 536 107
4.3.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR IN V/VO-VIRULENZ UND -PERSISTENZ EINER PGAABCD-
DELETIONSMUTANTE DES UPEC STAMMES UT189 108
4.3.4 UNTERSUCHUNG DER IN V/VO-VIRULENZ UND -FITNESS VON ATYPISCHEN
UPEC-ISOLATEN 111
4.3.5 UNTERSUCHUNG DER IN V/VO-VIRULENZ UND -FITNESS VON STEC
02:H6-LSOLATEN 113
5 DISKUSSION 115
5.1 UNTERSUCHUNG DER NATUERLICHEN GLYKOSYLIERUNG VON AG43 IN E. COLI
STAMM 536 115
5.1.1 EXPRESSION UND ISOLATION VON REKOMBINANTEM AG43A UND AG43B 115
5.1.2 UNTERSUCHUNGEN ZUM GLYKOSYLIERUNGSSTATUS VON AG43A UND AG43B 116
5.1.2.1 NACHWEIS DER PROTEINGLYKOSYLIERUNG MIT HILFE KOMMERZIELLER
GLYKOPROTEIN-
DETEKTIONSKITS 117
5.1.2.2 MASSENSPEKTROMETRISCHE UNTERSUCHUNG DES GLYKOSYLIERUNGSSTATUS
DER ISOLIERTEN
AG43-VARIANTEN (NANOELEKTROSPRAY-IONISATIONS-MASSENSPEKTROMETRIE
(NESI-MS))....
120
5.1.3 UEBERPRUEFUNG DER KUENSTLICHEN GLYKOSYLIERUNG VON AG43A IN E. COLI
STAMM 536 DM
125
5.1.4 UNTERSUCHUNGEN ZU EXPRESSION UND GLYKOSYLIERUNG VON AIDA-I IN E.
COLI 536 DM,
E. COLI 536 RDM UND E. COLI MG 1655 LFIM A//U 126
5.2 IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG MOEGLICHER GLYKOSYLTRANSFERASEN
IN E. COLI STAMM
536 129
5.2.1 IDENTIFIZIERUNG PUTATIVER GT-KODIERENDER *OPEN READING FRAMES IN
E. COLI STAMM
536 UND GENERIERUNG VON DELETIONSMUTANTEN 129
5.2.2 PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER GT-DELETIONSMUTANTEN 130
5.3 VERGLEICHSSTUDIEN ZUM UROPATHOGENEN VIRULENZPOTENTIAL AUSGEWAEHLTER
E. COLI STAEMME
MITTELS DES EXPERIMENTELLEN MAUSMODELLS DER AUFSTEIGENDEN
HARNWEGSINFEKTION (HWI).
137
5.3.1 UNTERSUCHUNG DER IN V/VO-VIRULENZ UND -FITNESS VON
AG/I43-DELETIONSMUTANTEN UND
KOMPLEMENTIERTEN MUTANTEN 137
5.3.2 UNTERSUCHUNG DER IN V/VO-VIRULENZ UND -FITNESS VON
UVRY-KOMPLEMENTANTEN DES
E. COLI STAMMES 536 139
IV
INHALTSVERZEICHNIS
5.3.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR IN W VO-VIRULENZ UND -PERSISTENZ EINER PGAABCD-
DELETIONSMUTANTE DES UPEC STAMMES UTI89 141
5.3.4 UNTERSUCHUNG DER IN WVO-VIRULENZ UND -FITNESS VON ATYPISCHEN
UPEC-ISOLATEN 143
5.3.5 UNTERSUCHUNG DER IN V/VO-VIRULENZ UND -FITNESS VON STEC
02:H6-LSOLATEN 145
5.4 ABSCHLIESSENDE WORTE UND AUSBLICK 147
6 LITERATUR 148
7 ANHANG 168
7.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 168
7.2 OLIGONUKLEOTIDE 171
7.3 ERGAENZENDE ERGEBNISSE DER MS-UNTERSUCHUNG DES GLYKOSYLIERUNGSSTATUS
DER ISOLIERTEN
AG43-VARIANTEN (NESI-MS) 175
7.4 UEBERSICHT UEBER DIE GLYKOSYLTRANSFERASEN (GTS) VON E. COLI STAMM 536
177
7.5 ERGAENZENDE ERGEBNISSE ZUR PHAENOTYPISCHEN CHARAKTERISIERUNG DER GT-
DELETIONSMUTANTEN 181
7.5.1 ERGEBNIS DER AUTOAGGREGATIONSSTUDIE 181
7.5.2 ERGEBNIS DES *CAS LIQUID ASSAYS NACH SCHWYN UND NEILANDS (1987))
182
7.6 VEROEFFENTLICHUNGEN 183
7.6.1 PUBLIKATIONEN 183
7.6.2 VORTRAEGE 183
7.6.3 POSTERPRAESENTATIONEN 183
7.7 LEBENSLAUF 184
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| spelling | Schiller, Roswitha Dorothee 1978- Verfasser (DE-588)1063317789 aut Studien zu Virulenzeigenschaften typischer und atypischer uropathogener Escherichia coli von Roswitha Dorothee Schiller Studies on virulence properties of typical and atypical uropathogenic Escherichia coli 2014 V, 185 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Zsfassung in dt. und engl. Sprache Würzburg, Univ., Diss., 2014 Escherichia coli (DE-588)4070959-0 gnd rswk-swf Harnwegsinfektion (DE-588)4023498-8 gnd rswk-swf Glykosylierung (DE-588)4269099-7 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Escherichia coli (DE-588)4070959-0 s Glykosylierung (DE-588)4269099-7 s Harnwegsinfektion (DE-588)4023498-8 s DE-604 Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:20-opus-103907 https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-103907 Resolving-System kostenfrei Volltext DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=027666827&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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