Untersuchung der oxidativen und pH-abhängigen Regulation der vakuolären Protonen-ATPase und calciumabhängigen vakuolären Membranleitfähigkeiten von Arabidopsis thaliana:
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2014
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| adam_text | UNTERSUCHUNG DER OXIDATIVEN UND PH-ABHAENGIGEN REGULATION
DER VAKUOLAEREN PROTONEN-ATPASE UND CALCIUMABHAENGIGEN
VAKUOLAEREN MEMBRANLEITFAEHIGKEITEN VON ARABIDOPSIS THALIANA
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES
NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES
DER JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET WUERZBURG
VORGELEGT VON
FLORIAN CHRISTIAN RIENMUELLER
GEBOREN IN STUTTGART
WUERZBURG 2014
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 DIE PFLANZLICHE VAKUOLE UND IHRE FUNKTIONEN IM UEBERBLICK 1
1.2 AKTIVER UND PASSIVER TRANSPORT AN DER VAKUOLENMEMBRAN 2
1.2.1 ANIONENTRANSPORT AM TONOPLASTEN 5
1.2.2 KATIONENTRANSPORT AM TONOPLASTEN 6
1.3 CALCIUMSIGNALE IM PFLANZLICHEN ORGANISMUS 9
1.3.1 INTRAZELLULAERE CALCIUMFREISETZUNG 12
1.4 AKTIVER PROTONENTRANSPORT AM TONOPLASTEN 12
1.4.1 MOLEKULARE STRUKTUR UND FUNKTIONSWEISE DER VAKUOLAEREN
PROTONEN-ATPASE 13
1.4.2 PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG UND REGULATION DER V-ATPASE 18
1.4.3 DIE INTRAZELLULAERE PH-HOMOEOSTASE 22
1.5 ZIELSETZUNG 24
2.0 MATERIAL UND METHODEN 25
2.1 PFLANZENANZUCHT UND PRAEPARATION VON ARABIDOPSIS THALIANA 25
2.1.1 ANZUCHTBEDINGUNGEN VON ARABIDOPSIS THALIANA FUER
PATCH-CLAMP-EXPERIMENTE ...25
2.1.2 PRAEPARATION DER ARABIDOPSIS THALIANA MESOPHYLLPROTOPLASTEN 26
2.1.3 VAKUOLENISOLATION AUS ARABIDOPSIS THALIANA MESOPHYLLPROTOPLASTEN
FUER PATCH-
CLAMP-EXPERIMENTE 26
2.1.4 STERILISATION UND AUSSAAT VON ARABIDOPSIS THALIANA FUER EXPERIMENTE
MIT
INTRAZELLULAEREN MIKROELEKTRODEN 27
2.1.5 ANZUCHTBEDINGUNGEN VON ARABIDOPSIS THALIANA KEIMLINGEN FUER
EXPERIMENTE
MIT INTRAZELLULAEREN MIKROELEKTRODEN 28
2.2 HERSTELLUNG DER VERWENDETEN LOESUNGEN 28
2.2.1 LOESUNGEN FUER PATCH-CLAMP-EXPERIMENTE 29
2.2.2 LOESUNGEN FUER EXPERIMENTE MIT INTRAZELLULAEREN MIKROELEKTRODEN UND
DER ZWEI-
ELEKTRODEN-SPANNUNGSKLEMME 33
2.3 DIE EINSTICH-TECHNIK VON INTRAZELLULAEREN MIKROELEKTRODEN 34
2.3.1 ANWENDUNG DER EINSTICH-TECHNIK VON INTRAZELLULAEREN MIKROELEKTRODEN
BEI
INTAKTEN ARABIDOPSIS THALIANA WURZELN 35
2.3.2 MESSPRINZIP DER ZWEI-ELEKTRODEN-SPANNUNGSKLEMMEN-TECHNIK 35
2.3.3 AUFBAU DES ZWEI-ELEKTRODEN-SPANNUNGSKLEMMEN-MESSPLATZES 36
2.3.4 HERSTELLUNG VON EINSTICH- UND REFERENZELEKTRODEN 38
2.3.5 CALCIUM-BILDGEBUNGSVERFAHREN UNTER VERWENDUNG DES
CALCIUMSENSITIVEN
FARBSTOFFS FURA-2 39
2.3.6 SPANNUNGSPROTOKOLLE UND DATENANALYSE DER EINSTICH-EXPERIMENTE 40
2.4 DIE PATCH-CLAMP-TECHNIK 41
2.4.1 ANWENDUNG DER PATCH-CLAMP-TECHNIK 42
2.4.2 FUNKTIONSWEISE DES PATCH-CLAMP-VERSTAERKERS 45
2.4.3 AUFBAU DES PATCH-CLAMP-MESSPLATZES 46
2.4.4 FUNKTION DER APPLIKATIONSPIPETTE 48
2.4.5 HERSTELLUNG VON MESS- UND REFERENZELEKTRODE 48
2.4.6 HERSTELLUNG VON MESS- UND APPLIKATIONSPIPETTE 49
2.4.7 SPANNUNGSPROTOKOLLE UND DATENANALYSE DER PATCH-CLAMP-MESSUNGEN 50
2.5 DIE VORZEICHENKONVENTION 52
2.5.1 NERNSTGLEICHUNG UND UMKEHRPOTENTIAL 52
2.6 THEORETISCHE GRUNDLAGEN ZUR BERECHNUNG DER
V-ATPASE-PROTONENKOPPLUNGSRATE .53
3. ERGEBNISSE 58
3.1 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER V-ATPASE 58
3.1.1 METHODIK DER ELEKTROPHYSIOLOGISCHEN UNTERSUCHUNG VON V-ATPASE- 58
STROEMEN IN ARABIDOPSIS THALIANA MESOPHYLLVAKUOLEN 58
3.1.2 EFFEKT DES VAKUOLAEREN PH-WERTS AUF DIE SPANNUNGSABHAENGIGKEIT DER
V-ATPASE ..60
3.1.3 PH-ABHAENGIGKEIT VON ATP-INDUZIERTEN PROTONENAUSWAERTSSTROEMEN IN
WILDTYP-
MESOPHYLLVAKUOLEN 63
3.1.4 EINFLUSS DES PH-WERTES AUF DIE PROTONENTRANSPORTKAPAZITAET UND
ATP-AFFINITAET
DER V-ATPASE IN MESOPHYLLVAKUOLEN 66
3.1.5 REGULATION DER V-ATPASE-PUMPAKTIVITAET DURCH OXIDATIONSMITTEL IN
MESOPHYLLVAKUOLEN 70
3.2 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE IN VIVO UNTERSUCHUNGEN VON VAKUOLAEREN
MEMBRANLEITFAEHIGKEITEN IN ARABIDOPSIS THALIANA WURZELN MIT HILFE DER
ZWEI-
ELEKTRODEN-SPANNUNGSKLEMME 74
3.2.1 LOKALISATION DER MIKROELEKTRODEN IN
WILDTYP-WURZELRHIZODERMISZELLEN 75
3.2.2 AENDERUNGEN DER MEMBRANLEITFAEHIGKEITEN NACH DEM EINSTICH VON
DOUBLE-
BARRELED ELEKTRODEN IN WURZELRHIZODERMISVAKUOLEN 76
3.2.3 UNTERSUCHUNG DER CALCIUMABHAENGIGEN REGULATION VAKUOLAERER
MEMBRANLEITFAEHIGKEITEN MIT HILFE DES FLUORESZENZFARBSTOFFES FURA-2 IN
TRICHOBLASTEN 79
4. DISKUSSION 84
4.1. DIE PROTONENKOPPLUNGSRATE DER V-ATPASE IN ABHAENGIGKEIT VON
LUMINALEN PH-
WERTEN 84
4.2 PH-ABHAENGIGE PARAMETER DER V-ATPASE-AKTIVITAET 87
4.2.1 ENTWICKLUNG EINES QUALITATIVEN MODELLS DER V-ATPASE PUMPAKTIVITAET
UNTER
BERUECKSICHTIGUNG DER ERMITTELTEN K
M
- UND V
MAX
- WERTE 91
4.3 REDOX-REGULATION DER V-ATPASE-PUMPAKTIVITAET 95
4.4
CALCIUMINDUZIERTE VERAENDERUNGEN IN DER LEITFAEHIGKEIT DER VAKUOLENMEMBRAN
IN
INTAKTEN TRICHOBLASTEN IN VIVO 97
5. ZUSAMMENFASSUNG 102
6. SUMMARY 104
7. ANHANG 106
7.1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 106
7.2 TABELLENVERZEICHNIS 107
7.3 LITERATURVERZEICHNIS 108
7.4 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 122
7.5 PUBLIKATIONEN 127
7.6 LEBENSLAUF 128
7.7 DANKSAGUNG 130
7.8 EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 131
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