Die Rolle des Tumorstammzellmarkers CD133 in der Initiierung von Tumoren:
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| adam_text | AUS DER KLINIK UND POLIKLINIK FUER HALS-NASEN-OHREN-HEILKUNDE DER
LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN
DIREKTOR: PROF. DR. MED. A. BERGHAUS
DIE ROLLE
DES
TUMORSTAMMZELLMARKERS
CD133 IN DER
INITIIERUNG VON
TUMOREN
DISSERTATION
ZUM ERWERB DES DOKTORGRADES DER MEDIZIN
AN DER MEDIZINISCHEN FAKULTAET DER
LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET ZU MUENCHEN
VORGELEGT VON
AXEL LECHNER
AUS
MUENCHEN
2014
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M
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS IV
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
2 EINLEITUNG 3
2.1 KREBS
- DEFINITION UND EPIDEMIOLOGISCHER UEBERBLICK 3
2.2 ENTSTEHUNG UND WACHSTUM MALIGNER NEOPLASIEN 3
2.3 EPITHELIAL-MESENCHYMALE TRANSITION (EMT) 4
2.4 ZELLEN DER TUMORUMGEBUNG (TUMOR MICROENVIRONMENT) 5
2.5 ZUFALLSPRINZIP ODER HIERARCHIE: KLONALE EVOLUTION UND
TUMORSTAMMZELLTHEORIE 5
2.6 DER TUMORSTAMMZELLMARKER CD133 9
2.6.1 STRUKTUR UND EIGENSCHAFTEN VON CD133 9
2.6.2 TRANSKRIPTIONSREGULATION DES CD133-GENS UND PROMOTORAKTIVITAET 10
2.6.3 SPLICEVARIANTEN UND PROTEINISOFORMEN VON CD133 11
2.6.4 SUBZELLULAERE LOKALISATION UND CD133 IN MEMBRANPARTIKELN 12
2.6.5 POSTTRANSLATIONALE MODIFIKATION VON CD133 13
2.6.6 EXPRESSION VON CD133 IN GESUNDEM GEWEBE 13
2.6.7 CD133-EPITOPDETEKTION UND EVALUATION VON CD133 ALS STAMMZELLMARKER
15
2.6.8 CD133* STAMMZELLEN IM GESUNDEN GEWEBE 15
2.6.9 CD133 IN KREBSSTAMMZELLEN SOLIDER TUMOREN 17
2.6.10 KLINISCHE AUSWIRKUNGEN VON CD133-EXPRESSION IN TUMOREN 19
2.6.11 ZUSAMMENHANG ZWISCHEN CD133-EXPRESSION IN TUMOREN UND
THERAPIERESISTENZ 20
2.6.12 UEBERBLICK UEBER MOEGLICHE FUNKTIONEN VON CD133 IN GESUNDEN UND
MALIGNEN ZELLEN.... 21
2.7 ZIELSETZUNG 23
3 MATERIAL UND METHODEN 24
3.1 MATERIAL 24
3.1.1 VERWENDETE CHEMIKALIEN 24
3.1.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 25
3.1.3 GERAETE 26
3.1.4 KITS, STANDARDS UND ENZYME 27
3.1.5 ANTIKOERPER 28
3.1.6 OLIGONUKLEOTIDPRIMER 29
3.1.7 PLASMIDE 29
3.1.8 ZELLLINIEN 30
3.1.9 DIENSTLEISTUNGEN 30
ES
3.2 METHODEN 31
3.2.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 31
3.2.1.1 ALLGEMEINE ZELLKULTURTECHNIKEN 31
3.2.1.2 ZELLZAHLBESTIMMUNG 31
3.2.1.3 TRANSFEKTION VON ZELLEN 32
3.2.1.4 BOYDEN-KAMMER - MIGRATION UND CHEMOTAXIS 32
3.2.1.5 SCRATCH ASSAY
- MIGRATION 32
3.2.1.6 ZELLZYKLUSVERTEILUNG 33
3.2.2 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNG 33
3.2.2.1 BESTIMMUNG DER OBERFLAECHENPROTEINEXPRESSION UND ZELLSORTIERUNG
33
3.2.2.2 MESSUNG DER ZELLZYKLUSVERTEILUNG 34
3.2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE ANALYSEVERFAHREN 34
3.2.3.1 QUANTITATIVE PROTEINBESTIMMUNG 34
3.2.3.2 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE UND WESTERN BLOTTING 34
3.2.3.3 ENZYMATISCHE DEGLYKOSYLIERUNG DURCH PNGASE F 35
3.2.4 MOLEKULARBIOLOGISCHE ANALYSEVERFAHREN 35
3.2.4.1 RNA-EXTRAKTION, QUANTITATIVE RNA-BESTIMMUNG UND GENERIERUNG VON
CDNA 35
3.2.4.2 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) UND AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 36
3.2.5 XENOTRANSPLANTATIONSMODELL 36
3.2.6 HISTOLOGISCHE UND IMMUNHISTOCHEMISCHE ANALYSEVERFAHREN 37
3.2.6.1 VORBEREITUNG UND FIXIERUNG DER PRAEPARATE 37
3.2.6.2 IMMUNHISTOCHEMISCHE UND IMMUNZYTOCHEMISCHE FAERBUNG 37
3.2.6.3 HAEMATOXYLIN-EOSIN-FAERBUNG 37
3.2.7 MICROARRAY-GENEXPRESSIONSANALYSE 38
4 ERGEBNISSE 39
4.1 CD133-EXPRESSION IN VERSCHIEDENEN KARZINOMZELLLINIEN UND
HEK293-WILDTYPELLEN 39
4.2 MAGNET-ASSISTIERTE TRANSFEKTION VON KARZINOMZELLLINIEN 40
4.3 ETABLIERUNG STABILER CD133-EXPRESSION IN HEK293-ZELLEN 42
4.4 CHARAKTERISIERUNG DER CD133-EXPRESSION IN HEK293-CD133
HLGH/L0W
-ZELLEN 43
4.5 PROLIFERATIONSVERHALTEN UND ZELLZYKLUSVERTEILUNG VON HEK293-CD133
HLGH/LOW
-ZELLEN 45
4.6 EVALUATION DES TUMORINITIIERUNGSVERHALTENS VON HEK293-CD133
HLGH/LOW
-ZELLEN IN VIVO 47
4.7 MIKROSKOPISCHE BEURTEILUNG ENTNOMMENER HEK293-CD133
H,8H/LOW
-TUMOREN 49
4.8 ANALYSE DES TRANSKRIPTOMS VON HEK293-CD133
HL8H/LOW
-ZELLEN 50
4.8.1 QUANTIFIZIERUNG UND QUALITAETSKONTROLLE DER AUSGANGS-RNA 51
4.8.2 MICROARRAY-HYBRIDISIERUNG, DATENANALYSE UND IDENTIFIKATION
DIFFERENTIELL EXPRIMIERTER
GENE 51
4.8.3 VALIDIERUNG DER MICROARRAY-ERGEBNISSE AUSGEWAEHLTER GENE 53
4.8.4 VERGLEICH DER MICROARRAY-ERGEBNISSE VON HEK293-CD133
HLGH/L0W
-ZELLEN
MIT CD133-
TRANSFIZIERTEN HELA-ZELLEN 54
5 DISKUSSION 56
5.1 CD133-EXPRESSION IN KARZINOMZELLLINIEN UND HEK293-WILDTYPZELLEN 56
5.2 MAGNET-ASSISTIERTE TRANSFEKTION VERSCHIEDENER ZELLLINIEN 57
5.3 ETABLIERUNG STABILER CD133-EXPRESSION IN HEK293-ZELLEN 58
5.4 CHARAKTERISIERUNG DER CD133-EXPRESSION IN HEK293-CD133
HL8H/LOW
-ZELLEN 59
5.5 WACHSTUMSVERHALTEN VON HEK293-CD133
HLBH/LOW
-ZELLEN IN VITRO 59
5.6 HEK293-CD133
H,GH
-ZELLEN ZEIGEN ERHOEHTE TUMORINDUKTION UND PROLIFERATION IN VIVO 61
5.7 IDENTIFIKATION MOEGLICHER ZIELGENE VON CD133 IN HEK293-ZELLEN 64
5.8 VERGLEICH DER MICROARRAY-ERGEBNISSE VON HEK293-CD133
HLGH
-ZELLEN
MIT TRANSIENT CD133-
TRANSFIZIERTEN HELA-ZELLEN 65
6 RESUEMEE UND AUSBLICK 66
7 LITERATURVERZEICHNIS 69
8 DANKSAGUNG 79
9 VEROEFFENTLICHUNG 80
10 LEBENSLAUF 81
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