Charakterisierung und Struktur-Funktionsanalyse der Glukosyltransferase Set A von Legionella pneumophila:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2013
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
I INHALTSVERZEICHNIS
II ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS
II 1 ABBILDUNGEN
II 2 TABELLEN
III ABKUERZUNGEN
1 EINLEITUNG 1
1.1 LEGIONELLA PNEUMOPHILA 1
1.1.1 EPIDEMIOLOGIE 1
1.1.2 AUSBREITUNG 1
1.1.3 LEGIONELLOSE BEIM TIER 3
1.1.4 AUFNAHME VON LEGIONELLA PNEUMOPHILA 3
1.1.5 LEBENSZYKLUS VON LEGIONELLA PNEUMOPHILA 4
1.2 EFFEKTORPROTEINE AUS LEGIONELLA UND DEREN EINFLUSS AUF DIE
WIRTSZELLE 5
1.2.1 PHYSIOLOGISCHER ABLAUF DER VESIKELMATURATION 6
1.2.2 WIE LEGIONELLA DEN VESIKELTRANSPORT VERAENDERT - DIE *LEGIONELLA
CONTAINING VACUOLE .... 8
1.2.3 DAS DOT/ICM TYP IV-SEKRETIONSSYSTEM 9
1.2.4 DOT/ICM-SUBSTRATE 10
1.2.5 BEISPIELE FUER FUNKTIONEN UND INTERAKTIONSPARTNER VON L.
PNEUMOPHILA
EFFEKTORPROTEINEN 11
1.3 GLYKOSYLTRANSFERASEN 14
1.3.1 GLYKOSYLTRANSFERASEN 14
1.3.2 EINTEILUNG VON GLYKOSYLTRANSFERASEN 14
1.3.3 MECHANISMUS DER GLYKOSYLTRANSFERASEREAKTION 16
1.3.4 BAKTERIELLE GLYKOSYLTRANSFERASEN ALS TOXINE 18
1.3.5 GLUKOSYLTRANSFERASEN AUS LEGIONELLA PNEUMOPHILA 19
1.3.6 DIE LEGIONELLA PNEUMOPHILA GLUKOSYLTRANSFERASE SET A 19
2 ZIELE DER ARBEIT 21
3 MATERIAL & METHODEN 22
3.1 MATERIALIEN 22
3.1.1 BEZUGSQUELLEN VON CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIAL 22
3.1.2 ALLGEMEINE PUFFER, LOESUNGEN UND MEDIEN 23
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INHALTSVERZEICHNIS
3.1.3 ALLGEMEIN VERWENDETE GERAETE 23
3.1.4 STAEMME, ZELLLINIEN UND PLASMIDE 24
3.1.5 ANTIKOERPER 27
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 28
3.2.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION 28
3.2.2 VERDAU VON DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN 28
3.2.3 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 29
3.2.4 AUFREINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN UND
ANDEREN DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN ...
29
3.2.5 LIGATIONVON DNA-FRAGMENTEN 29
3.2.6 TRANSFORMATION VON PLASMIDEN IN E. COLI 30
3.2.7 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E.COLI. 30
3.2.8 ALKOHOL-FAELLUNG 31
3.2.9 KONZENTRATIONS- UND REINHEITSBESTIMMUNG VON DNA 31
3.2.10 ZIELGERICHTETE MUTAGENESE 31
3.2.11 SEQUENZIERUNG DER DNA 32
3.2.12 VERWENDETE PUFFER, MEDIEN UND LOESUNGEN 33
3.2.13 GERAETE UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 33
3.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 34
3.3.1 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IN E. COLI 34
3.3.2 AUFREINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE AUS E. COLI 34
3.3.3 BESTIMMUNG DER KONZENTRATION VON PROTEINLOESUNGEN 35
3.3.4 DIALYSE VON PROTEINLOESUNGEN 35
3.3.5 UMPUFFERN VON PROTEINEN MIT PD 10 SAEULEN 35
3.3.6 TCA-FAELLUNG 36
3.3.7 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 36
3.3.8 PROTEINDETEKTION DURCH IMMUNOBLOT-ANALYSE (WESTERN-BLOT) 37
3.3.9 *STRIPPEN EINES WESTERN-BLOTS 37
3.3.10 BESTIMMUNG DER GLUKOHYDROLASE-AKTIVITAET 38
3.3.11 BESTIMMUNG DER GLUKOSYLTRANSFERASEAKTIVITAET 38
3.3.12 MASSENSPEKTROMETRIE (LC-MS/MS Q-TOF) 39
3.3.13 *PIP-STRIP ASSAY 40
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.14 BIACORE (OBERFLAECHEN-PLASMON-RESONANZ-SPEKTROSKOPIE) 40
3.3.15 VERWENDETE PUFFER, MEDIEN UND LOESUNGEN 41
3.3.16 GERAETE UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 43
3.4 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 44
3.4.1 PASSAGIEREN VON
ZELLEN 44
3.4.2 TRANSFEKTION 44
3.4.3 FLUORESZENZ-MIKROSKOPIE 45
3.4.4 LYSE VON ZELLEN 46
3.4.5 AUFREINIGUNG VON ENDOSOMEN AUS HELA-ZELLEN MIT
HILFE VON GFP-
IMMUNOPRAEZIPITATION 46
3.4.6 AUFREINIGUNG VON ENDOSOMEN AUS HELA-ZELLEN UEBER EINEN
SACCHAROSEGRADIENTEN 47
3.4.7 VERWENDETE PUFFER, MEDIEN UND LOESUNGEN 48
3.4.8 GERAETE UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 48
3.5 HEFE METHODEN 48
3.5.1 HEFETRANSFORMATION 48
3.5.2 DEFINIERTE UEBERTRAGUNG VON HEFEKLONEN AUF NEUE AGARPLATTEN 50
3.5.3 HEFE-*SPOTTEST ZUR WACHSTUMSKONTROLLE 50
3.5.4 PLASMIDPRAEPARATION AUS HEFEN (*STET-PREP ) 51
3.5.5 VERWENDETE PUFFER, MEDIEN UND LOESUNGEN 51
3.5.6 GERAETE UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 52
4 ERGEBNISSE 53
4.1 CHARAKTERISIERUNG DER LOKALISATIONSDOMAENE 53
4.1.1 BESTIMMUNG DES BINDUNGSPARTNERS DER LOKALISATIONSDOMAENE AN FRUEHEN
ENDOSOMEN. 53
4.1.2 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTE DER LOKALISATIONSDOMAENE ZU
PI3P 55
4.2 WICHTIGE AMINOSAEUREN DER GLUKOSYLTRANSFERASEDOMAENE VON SET A 56
4.2.1 BESTIMMUNG DER GLUKOHYDROLASEAKTIVITAET DER SET A-MUTANTEN 57
4.2.2 UNTERSUCHUNG DER GLUKOSYLTRANSFERASEAKTIVITAET DER SET A-MUTANTEN
60
4.2.3 ANALYSE DER ZYTOTOXIZITAET VERSCHIEDENER SET A-MUTANTEN IN
SACCHAROMYCES
CEREVISIOE 62
4.3 CHARAKTERISIERUNG DER FUNKTION DER SET A-DOMAENEN IN VIVO 63
4.3.1 AUSWIRKUNG DER EXPRESSION VERSCHIEDENER SET A-VERKUERZUNGEN AUF DAS
HEFEZELLWACHSTUM 63
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.2 COTRANSFORMATION VON BEIDEN SET A EINZEL-DOMAENEN IN EINE HEFEZELLE
64
4.3.3 ENZYM-UND LOKALISATIONSDOMAENE COLOKALISIEREN AN ENDOSOMEN 65
4.4 HEFE-SCREEN ZUR IDENTIFIKATION DES SUBSTRATES
VON SET A 66
4.4.1 HEFE *MULTI COPY SUPPRESSOR SCREEN 67
4.4.2 VERIFIZIERUNG DER SUBSTRAT-KANDIDATEN DES *MULTI COPY SUPPRESSOR
SCREENS 70
4.5 UNTERSUCHUNG DER ENDOSOMENZUSAMMENSETZUNG UNTER SET A-EINFLUSS 71
4.5.1 UNTERSUCHUNG DER ENDOSOMAIEN PROTEINAUSSTATTUNG UNTER DEM EINFLUSS
VON SET A 71
4.5.2 WEITERFUEHRENDE ANALYSE DER MASSENSPEKTROMETRISCH ERMITTELTEN
ENDOSOMAIEN
PROTEINE 73
4.5.3 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON
SET A AUF DIE VESIKELMATURATION 74
5 DISKUSSION 76
5.1 DIE SET A-LOKALISATIONSDOMAENE 77
5.2 IDENTIFIKATION WICHTIGER AMINOSAEUREN DER GLUKOSYLTRANSFERASEDOMAENE
78
5.3 FUNKTION UND INTERAKTION DER SET A-DOMAENEN IN VIVO 81
5.4 HEFE-SCREEN ZUR IDENTIFIKATION DES SUBSTRATES
VON SET A 83
5.5 SET A BEEINFLUSST DIE ENDOSOMALE PROTEINZUSAMMENSETZUNG 85
6 AUSBLICK 87
7 ZUSAMMENFASSUNG 89
8 SUMMARY 91
9 LITERATURVERZEICHNIS 93
10 DANKSAGUNGEN 108
11 ERKLAERUNG 110
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