Etablierung der spezifischen Detektion alternativ gespleißter Varianten der sauren Sphingomyelinase:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2014
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| adam_text | ETABLIERUNG DER SPEZIFISCHEN DETEKTION
ALTERNATIV GESPLEISSTER VARIANTEN
DER SAUREN SPHINGOMYELINASE
DER MEDIZINISCHEN FAKULTAET
DER FRIEDRICH-ALEXANDER-UNIVERSITAET
ERLANGEN-NUERNBERG
ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DR. MED.
VORGELEGT VON
CHRISTINE NAGEL
AUS
ERLANGEN
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INHALTSVERZEICHNIS IV
INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
2 SUMMARY 3
3 EINLEITUNG 5
3.1 SPHINGOLIPIDE 5
3.1.1 AUFBAU UND FUNKTION DER SPHINGOLIPIDE 5
3.1.2 SPHINGOLIPIDE IN DER BIOLOGISCHEN MEMBRAN 7
3.1.3 CERAMID ALS ZENTRALES MOLEKUEL DES SPHINGOLIPIDSTOFFWECHSELS 7
3.1.4 SPHINGOMYELINASEN ALS REGULATOREN DES SPHINGOLIPIDSTOFFWECHSELS 8
3.2 SAURE SPHINGOMYELINASE 9
3.2.1 EIGENSCHAFTEN UND TRANSKRIPTION DES
SPHINGOMYELINPHOSPHODIESTERASE-GENS 9
3.2.2 EIGENSCHAFTEN DES PROTEINS DER SAUREN SPHINGOMYELINASE 11
3.2.3 SPLEISSVARIANTEN DER SAUREN SPHINGOMYELINASE 12
3.3 REGULATION DER AKTIVITAET DER SAUREN SPHINGOMYELINASE 16
3.3.1 REGULATORISCHE FAKTOREN 16
3.3.2 TRANSKRIPTIONELLE REGULATION 17
3.3.3 POSTTRANSLATIONALE MODIFIKATION 17
3.3.4 HEMMUNG DER SAUREN SPHINGOMYELINASE 18
3.4 PATHOLOGISCHE AKTIVITAET DER SAUREN SPHINGOMYELINASE 19
3.4.1 ERNIEDRIGTE AKTIVITAET DER SAUREN SPHINGOMYELINASE 19
3.4.2 ERHOEHTE AKTIVITAET DER SAUREN SPHINGOMYELINASE 20
3.4.3 GESTEIGERTE AKTIVITAET DER SAUREN SPHINGOMYELINASE BEI DEPRESSION
20
3.5 FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG DER ARBEIT 21
4 MATERIALIEN UND METHODEN 23
4.1 MATERIALIEN 23
4.1.1 ENZYME 23
4.1.2 VEKTOREN UND PLASMIDE 23
4.1.3 PUFFER 24
4.1.4 STANDARDS 25
4.1.5 CHEMIKALIEN UND HILFSMITTEL 25
4.1.6 GERAETE UND APPARATUREN 26
4.2 METHODEN 27
4.2.1 DESOXYRIBONUKLEINSAEURE (DNA) 27
4.2.1.1 AUSWAHL DER PRIMER 27
4.2.1.2 REVERSE-TRANSKRIPTION-POLYMERASE-KETTENREAKTION 27
4.2.1.3 QUANTITATIVE RT-PCR 29
INHALTSVERZEICHNIS V
4.2.1.4 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 35
4.2.2 RIBONUKLEINSAEURE (RNA) UND KOMPLEMENTAERE DNA (CDNA) 37
4.2.2.1 ISOLATION UND AUFREINIGUNG VON RNA AUS PROBANDENBLUT 37
4.2.2.2 BESTIMMUNG DER RNA-KONZENTRATION 38
4.2.2.3 UEBERPRUEFUNG DER RNA MIT DER GELELEKTROPHORESE 39
4.2.2.4 CDNA-SYNTHESE 39
4.2.2.5 UEBERPRUEFUNG DER CDNA 40
4.2.3 BIOINFORMATISCHE ANALYSEN 41
4.2.3.1 UEBERPRUEFUNG MIT BLAST 41
4.2.3.2 UEBERPRUEFUNG MIT CLUSTAL W UND PDRAW 41
5 ERGEBNISSE 42
5.1 OPTIMIERUNG DER PCR-BEDINGUNGEN 42
5.1.1 MAGNESIUMCHLORID 43
5.1.2 DIMETHYLSULFOXID 44
5.1.3 T EMPERATUR 44
5.1.4 TESTUNG AUF SPEZIFITAET 45
5.2 ETABLIERUNG SPEZIFISCHER PRIMER FUER ASM-SPLEISSVARIANTE 1 46
5.2.1 PRIMERDESIGN 46
5.2.2 OPTIMIERUNG DER TEMPERATUR 48
5.2.3 TESTUNG AUF SPEZIFITAET 50
5.3 ETABLIERUNG SPEZIFISCHER PRIMER FUER ASM-SPLEISSVARIANTE 5 51
5.3.1 PRIMERDESIGN 51
5.3.2 OPTIMIERUNG DER TEMPERATUR 52
5.3.3 TESTUNG AUF SPEZIFITAET 54
5.4 ETABLIERUNG SPEZIFISCHER PRIMER FUER ASM-SPLEISSVARIANTE 6 56
5.4.1 PRIMERDESIGN 56
5.4.2 OPTIMIERUNG DER TEMPERATUR 58
5.4.3 TESTUNG AUF SPEZIFITAET 60
5.5 ETABLIERUNG SPEZIFISCHER PRIMER FUER ASM-SPLEISSVARIANTE 7 61
5.5.1 PRIMERDESIGN 61
5.5.2 OPTIMIERUNG DER TEMPERATUR 62
5.5.3 TESTUNG AUF SPEZIFITAET 63
5.6 BESTAETIGUNG DER SPEZIFITAET UND ANNEALINGTEMPERATUR DER PRIMER
DURCH QUANTITATIVE PCR 64
5.7 ETABLIERTE PRIMER IM UEBERBLICK 66
5.8 EXPRESSIONSMUSTER DER ASM-SPLEISSVARIANTEN BEI GESUNDEN
PROBANDEN 69
5.8.1 NACHWEIS DER EXPRESSION ALLER SPLEISSVARIANTEN MIT DER REVERSEN-
TRANSKRIPTION-PCR 69
5.8.2 QUANTIFIZIERUNG DES EXPRESSIONSMUSTERS MIT QUANTITATIVER RT-PCR 70
INHALTSVERZEICHNIS VI
6 DISKUSSION 73
6.1 PRIMER FUER DIE AMPLIFIKATION DER ASM-SPLEISSVARIANTEN WURDEN
ERFOLGREICH ETABLIERT 73
6.1.1 DESIGN UND IN SILICO ANALYSE DER PRIMER 74
6.1.2 OPTIMIERUNG DER PCR-BEDINGUNGEN 76
6.1.3 UEBERPRUEFUNG DER PRODUKTSPEZIFITAET 78
6.2 ETABLIERTE PRIMER EIGNEN SICH AUCH FUER DIE QUANTITATIVE
EXPRESSIONS-ANALYSE 79
6.3 GESUNDE PROBANDEN WEISEN UNTERSCHIEDLICHE EXPRESSIONSMUSTER
DER ASM-SPLEISSVARIANTEN AUF 81
6.4 AUSBLICK 84
LITERATURVERZEICHNIS 85
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 95
VERZEICHNIS DER VEROEFFENTLICHUNGEN 98
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 99
TABELLENVERZEICHNIS 100
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