Einfluss von Rac-GTPasen auf das Tumor-Homing von hämatopoetischen Stammzellen:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2013
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 HAEMATOPOETISCHE STAMMZELLEN 1
1.2 NACHWEIS UND
ISOLIERUNG VON HAEMATOPOETISCHEN
STAMMZELLEN 3
1.3 TRANSPLANTATION UND HOMING
VON HAEMATOPOETISCHEN STAMMZELLEN 4
1.4 MOBILISIERUNG VON HAEMATOPOETISCHEN
STAMMZELLEN 7
1.5 ZELLADHAESIONSMOLEKUELE UND MIGRATION
VON HAEMATOPOETISCHEN
STAMMZELLEN 8
1.6 DIE FAMILIE DER RHO
GUANOSINTRIPHOSPHATASEN 12
1.6.1 DIE REGULATION DES AKTIVITAETSZUSTANDES VON
RHO GTPASEN 13
1.7 FUNKTION VON RAE
GUANOSINTRIPHOSPHATASEN IN HSC 17
1.7.1 DIE FUNKTION VON
RAC1 IN HSC 19
1.7.2 DIE FUNKTION VON
RAC2 IN HSC 20
1.7.3 DIE FUNKTION VON RAC1
UND RAC2
IN HSC 21
1.7.4 DIE FUNKTION VON
RAC3 23
1.8 DIE ROLLE VON KNOCHENMARK-ABGELEITETEN
ZELLEN IN TUMOREN 23
2. FRAGESTELLUNG UND ZIELE 28
3. MATERIAL 29
3.1 MAUSSTAEMME 29
3.2 ZELLLINIEN 29
3.2.1 B16 29
3.2.2 BEND.3 29
3.2.3 BFS-1 30
3.2.4 FDCP-MIX 30
3.2.5 HUVEC 30
3.2.6 LLC 30
3.3 PLASMIDE UND SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE 31
3.3.1 PCR-PRIMER 31
3.3.2 PLASMIDE 31
3.3.3 SIRNA 32
3.4 ANTIKOERPER 33
3.4.1 ANTIKOERPER FUER DIE DURCHFLUSSZYTOMETRIE 33
3.4.2 ANTIKOERPER FUER DIE IMMUNFLUORESZENZ 34
3.4.3 ANTIKOERPER FUER DIE IMMUNHISTOCHEMIE 35
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INHALTSVERZEICHNIS
3.4.4 FUNKTIONSBLOCKIERENDE ANTIKOERPER 35
3.5 CHEMIKALIEN UND
REAGENZIEN 36
3.5.1 ALLGEMEINE CHEMIKALIEN 36
3.5.2 ENZYME 37
3.5.3 PCR-REAGENZIEN 38
3.5.4 REAGENZIEN FUER DIE
IMMUNFLUORESZENZ UND IMMUNHISTOCHEMIE 38
3.5.5 SUBSTRATE FUER DIE
DURCHFLUSSKAMMER 38
3.5.6 ZYTOKINE 39
3.6 PUFFER 39
3.7 KULTURMEDIEN UND
REAGENZIEN FUER DIE
ZELLKULTUR 41
3.7.1 ZELLKULTURMEDIEN 41
3.7.2 REAGENZIEN FUER DIE
ZELLKULTUR 42
3.7.3 BAKTERIENKULTURMEDIEN 43
3.8 MATERIALIEN 43
3.8.1 ALLGEMEINE VERBRAUCHSMATERIALIEN 43
3.8.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN FUER DIE ZELLKULTUR 44
3.8.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN FUER DIE DURCHFLUSSKAMMER 45
3.8.4 GEBRAUCHSMATERIAIIEN 45
3.9 KITS 45
3.10 SOFTWARE 46
3.11 GERAETE 46
4. METHODEN 48
4.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 48
4.1.1 ALLGEMEINE BEDINGUNGEN FUER
DIE KULTIVIERUNG VON SAEUGERZELLEN 48
4.1.2 PASSAGIEREN VON SAEUGERZELLEN 48
4.1.3 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 49
4.1.4 EINFRIEREN UND AUFTAUEN
VON SAEUGERZELLEN 49
4.1.5 ISOLIEREN VON
LEUKOZYTEN AUS VOLLBLUT 50
4.1.6 ISOLIERUNG VON MURINEN
KNOCHENMARK- UND
MILZZELLEN 50
4.1.7 BESTIMMUNG DER KLONOGENITAET VON
HAEMATOPOETISCHEN STAMM-
UND VORLAEUFERZELLEN 51
4.1.8 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON
FDCP-MIX ZELLEN MIT PLASMID-DNA
ODER SIRNA 51
4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 52
4.2.1 TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN
BAKTERIEN MIT PLASMID-DNA
UND PLASMIDAMPLIFIKATION 52
4.2.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS
BAKTERIEN 53
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.3 SEQUENZSPEZIFISCHE HYDROLYSE VON
DNA MIT RESTRIKTIONSENDO-
NUKLEASEN 53
4.2.4 ISOLIERUNG VON DNA AUS
VOLLBLUT 53
4.2.5 ISOLIERUNG VON DNA AUS
MAUSSCHWANZBIOPSATEN 54
4.2.6 ISOLIERUNG VON DNA AUS
MURINEN ORGANEN 54
4.2.7 AUFREINIGUNG VON
DNA DURCH PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION 54
4.2.8 ISOLIERUNG VON RNA AUS
HAEMATOPOETISCHEN ZELLEN 55
4.2.9 PHOTOMETRISCHE NUKLEINSAEURE-QUANTIFIZIERUNG 56
4.2.10 GENOTYPISIERUNG MITTELS
POLYMERASE-KETTENREAKTION 56
4.2.11 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA ZU ANALYSEZWECKEN 57
4.2.12 CDNA-MICRORARRAY 58
4.3 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 59
4.3.1 FLUORESZENZDURCHFLUSSZYTOMETRIE 59
4.3.2 ANREICHERUNG VON KNOCHENMARK-PROGENITORZELLEN
MITTELS MACS-
ISOLIERUNG 60
4.3.3 ENZYME-IINKED IMMUNO
SORBENT ASSAY (ELISA) 60
4.3.4 HERSTELLUNG VON PARAFFINSCHNITTEN 61
4.3.5 HERSTELLUNG VON
GEFRIERSCHNITTEN 61
4.3.6 IMMUNHISTOCHEMISCHE FAERBUNG VON
ZELLEN 62
4.3.7 IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG VON ZELLEN 63
4.4 METHODEN ZUR ANALYSE DER ZELLMIGRATION 63
4.4.1 AUFBAU, VORBEREITUNG UND
BESCHICHTUNG DER
DURCHFLUSSKAMMER 63
4.4.2 BERECHNUNG DER WANDSCHUBSPANNUNG 64
4.4.3 UNTERSUCHUNG DER ZELLADHAESION
IN DER
DURCHFLUSSKAMMER 65
4.4.4 ANALYSE DES ROLLINGS UND
TRANSIENTER INTERAKTIONEN IN DER
DURCHFLUSSKAMMER 66
4.4.5 ANALYSE DER IN V/FRO-MIGRATION VON HAEMATOPOETISCHEN
PROGENITORZELLEN 67
4.4.6 ANALYSE DER CHEMOTAXIS VON
HAEMATOPOETISCHEN ZELLEN 67
4.4.7 STATISTISCHE ANALYSEN 68
4.5 TIEREXPERIMENTELLE METHODEN 68
4.5.1 ALLGEMEINE BEDINGUNGEN FUER
DIE ZUCHT VON VERSUCHSMAEUSEN 68
4.5.2 INTRAPERITONEALE INJEKTION VON
POLY-IC 69
4.5.3 BLUTENTNAHME BEI
MAEUSEN 69
4.5.4 ETABLIERUNG VON
SUBKUTANEN TUMOREN 70
4.5.5 ETABLIERUNG VON
LUNGENMETASTASEN 71
4.5.6 KNOCHENMARKTRANSPLANTATION BEI
MAEUSEN 71
4.5.7 LUNGENPRAEPARATION UND
PERFUSION FUER DIE
QUANTITATIVE MORPHOMETRIE 72
4.5.8 STEREOLOGISCHE ANALYSE VON
TUMOREN 72
4.5.9 ANALYSE DES IN WVO-TUMORHOMINGS 73
INHALTSVERZEICHNIS
5. ERGEBNISSE 75
5.1 DELETION VON RAC1 UND RAC2 IN HAEMATOPOETISCHEN STAMM- UND
VORLAEUFERZELLEN DES
KNOCHENMARKS 75
5.2 DIFFERENTIELLE GENEXPRESSION VON RAEZ* LIN SCA1
* KNOCHENMARK-
VORLAEUFERZELLEN 78
5.3 ANALYSE DER ADHAESION VON HAEMATOPOETISCHEN
STAMM- UND
VORLAEUFERZELLEN UNTER RUSSBEDINGUNGEN 79
5.4 ADHAESION VON HAEMATOPOETISCHEN
VORLAEUFERZELLEN IN ABHAENGIGKEIT
VON SDF-1
A UND RAE 80
5.5 ADHAESION VON RAC-DEFIZIENTEN HAEMATOPOETISCHEN VORLAEUFERZELLEN
AN ENDOTHELZELLEN 81
5.6 ADHAESION VON RAO-DEFIZIENTEN
HAEMATOPOETISCHEN VORLAEUFERZELLEN
AN DAS ADHAESIONSMOLEKUEL VCAM-1 84
5.7 EINFLUSS DER RAC-DEFIZIENZ AUF ADHAESION, TRENSMIGRATION
UND
CHEMOTAXIS VON HAEMATOPOETISCHEN VORLAEUFERZELLEN 86
5.8 ANALYSE DER INTERAKTION
VON FLAODEFIZIENTEN HAEMATOPOETISCHEN
STAMM- UND VORLAEUFERZELLEN
UNTER RUSSBEDINGUNGEN 88
5.9 INFILTRATION VON
TUMOREN DURCH HAEMATOPOETISCHE
STAMMZELLEN 92
5.10 TUMOR-HOMING VON FLAO-DEFIZIENTEN HSC 93
5.11 TUMORE MOBILISIEREN HAEMATOPOETISCHE STAMM-
UND VORLAEUFERZELLEN 96
5.12 CHEMOTAXIS VON FLAODEFIZIENTEN HAEMATOPOETISCHEN VORLAEUFERZELLEN 97
5.13 TUMORWACHSTUM IN FLAC-DEFLZIENTEN MAEUSEN 98
5.14 LOKALES TUMORWACHSTUM UND METASTASENBILDUNG
IN RAC2-
DEFIZIENTEN MAEUSEN 100
5.15 QUANTITATIVE ANALYSE VON GEFAESSEN
UND CD45* ZELLEN
IN TUMOREN
VON RACR^FIAC^-MAEUSEN 101
5.16 QUANTITATIVE ANALYSE VON TUMORGEFAESSEN UND
CD45* ZELLEN
IM
TUMOR VON F?AC?*~-MAEUSEN 103
5.17 QUANTITATIVE ANALYSE VON TUMORENDOTHELIEN UND CD45* ZELLEN
IN
LUNGENMETASTASEN VON RAC2
+
~-MAEUSEN 105
5.18 EINFLUSS VON TIAML AUF DIE CHEMOTAXIS
VON HAEMATOPOETISCHEN
VORLAEUFERZELLEN 107
5.19 EINFLUSS VON TIAML AUF DAS TUMOR-HOMING
VON HAEMATOPOETISCHEN
VORLAEUFERZELLEN 108
INHALTSVERZEICHNIS
6. DISKUSSION 110
6.1 DIE GLEICHZEITIGE DELETION VON
RAC1 UND RAC2 FUEHRT ZU EINER
MASSIVEN MOBILISIERUNG VON HSC 110
6.2 DIE ADHAESION VON HSC
UNTER FIUSSBEDINGUNGEN IST
ABHAENGIG
VON RAC1
UND IM GERINGEREN MABE VON
RAC2 112
6.3 RACT^RACZHSC ZEIGEN VERMEHRTES ROLLING 114
6.4 RAC1~
L
~RAC2^~ HSC SIND NICHT MEHR RESPONSIV
AUF DAS CHEMOKIN
SDF-1A 115
6.5 DAS TUMOR-HOMING VON
HSC IST
ABHAENGIG VON RAC1
UND RAC2 118
6.6 RAC2~*~ MAEUSE HABEN
EIN BESCHLEUNIGTES
TUMORWACHSTUM UND
EINE VERSTAERKTE METASTASENBILDUNG 120
6.7 EINFIUSS VON RAE
GTPASEN AUF DAS TUMOR-HOMING
VON
HAEMATOPOETISCHEN STAMMZELLEN:
EIN AUSBLICK 124
7. ZUSAMMENFASSUNG 126
7.1 ZUSAMMENFASSUNG 126
7.2 SUMMARY 128
8. LITERATURVERZEICHNIS 130
9. ANHANG 148
9.1 DATENANHANG 148
9.1.1 ANALYSE DER DIFFERENTIELLEN
GENEXPRESSIONVON RACZ* LIN SCA1
*
KNOCHENMARK-VORLAEUFERZELLEN 148
9.1.2 STEREOLOGISCHE ANALYSE VON
TUMOREN IN FLAE-DEFIZIENTEN MAEUSEN 155
9.2 TABELLARISCHER LEBENSLAUF 159
9.3 AKADEMISCHE LEHRER 160
9.4 DANKSAGUNG 161
9.5 EHRENWOERTLICHE ERKLAERUNG 162
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