Chitosanhydrogele als Matrix zur Entwicklung von Depotsystemen für GnRH-Antagonisten mit retardierter Wirkstofffreisetzung:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
2013
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adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
DANKSAGUNG 4
INHALTSVERZEICHNIS 5
ABKUERZUNGEN UND AKRONYME 12
1 GINLEITUNG 14
1.1 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 14
1.2 DEPOTSYSTEME 16
1.2.1 KLASSIFIZIERUNG VON DEPOTSYSTEMEN 16
1.2.2 POLYMERE HYDROGELE 17
1.2.3 WIRKSTOFFREISETZUNG AUS POLYMEREN HYDROGELEN 19
1.2.4 KINETISCHE MODELLE ZUR FREISETZUNG AUS POLYMEREN HYDROGELEN 20
1.3 CHITOSAN UND
SEINE DERIVATE 25
1.3.1 VORKOMMEN UND PHYSIKALISCHE EIGENSCHAFTEN 25
1.3.2 DEPOLYMERISIERUNG HOCHMOLEKULARER CHITOSANE 29
1.3.3 ANWENDUNG ALS TRAEGERMATRIX 31
1.4 GNRH-ANALOGA 34
1.4.1 GNRH ALS REGULATOR DER GONADALEN PITUAEREN ACHSE 34
1.4.2 KLASSIFIZIERUNG DER GNRH-ANALOGA 36
1.4.2.1 GNRH-SUPERAGONISTEN 36
1.4.2.2 GNRH-SUPERANTAGONISTEN 37
1.5 DEPOTFORMULIERUNGEN FUER GNRH-ANALOGA 41
1.6 DIE CHIMAERE HP14/30 ALS POTENTIELLES IMMUNISIERUNGSKONSTRUKT GEGEN
M.
PNEUMONIAE 47
2 MATERIAL UND METHODEN 52
2.1 GNRH-ANALOGA 52
2.2 KOMPLEXPARTNER 52
2.3 LOESUNGSMITTEL UND HILFSSTOFFE 52
2.4 GERAETE UND VERSUCHSTIERE 53
2.4.1 GERAETE 53
2.4.2 VERSUCHSTIERE 55
2.5 DEPOLYMERISATION VON CHITOSAN IMW 55
2.5.1 SAURE HYDROLYSE MIT SALZSAEURE 55
2.5.2 SAURE HYDROLYSE MIT PHOSPHORSAEURE 56
5
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INHALTSVERZEICHNIS
2.6 HERSTELLUNG DER PEPTID-PARTNER-KOMPLEXE 56
2.6.1 HERSTELLUNG DER CETRORELIX-KOMPLEXE 56
2.6.1.1 2-KOMPONENTENKOMPLEX 56
2.6.1.2 SANDWICHKOMPLEX 57
2.6.1.3 NANOVESIKELKOMPLEX 57
2.6.2 HERSTELLUNG DER OZARELIX-KOMPLEXE 58
2.6.2.1 2-KOMPONENTENKOMPLEX 58
2.6.2.2 SANDWICHKOMPLEX 58
2.6.3 HERSTELLUNG DER CHIMAERE HP14/30-KOMPLEXE 59
2.6.3.1 2-KOMPONENTENKOMPLEX 59
2.6.3.2 SANDWICHKOMPLEX 60
2.7 FLUORESZENZMARKIERUNG VON CHITOSAN MIT
FLUORESCEIN-5-ISOTHIOCYANAT....60
2.8 ISOLIERUNG UND AUFARBEITUNG VON ENZYMEXTRAKT AUS
MEERSCHWEINCHENLEBER 62
2.9 TIERVERSUCHE MIT DER CHIMAERE HP14/30 62
2.9.1 PRAEPARATION DES 2-KOMPONENTENKOMPLEXES FUER DIE TIERVERSUCHE 63
2.9.2 IMMUNISIERUNGSSCHEMA UND TESTGRUPPEN DER TIERVERSUCHE 63
2.9.3 IMMUNISIERUNG DER MEERSCHWEINCHEN 64
2.9.4 PROBENNAHME WAEHREND DES TIERVERSUCHES 65
2.9.4.1 NASALE WASCHUNG (NALF) 65
2.9.4.2 RACHENABSTRICH 65
2.9.4.3 BRONCHIALLAVAGE (BALF) 65
2.9.4.4 HERZPUNKTION 66
2.10 ANALYTISCHE ARBEITEN 66
2.10.1 UBBELOHDE-VISKOSIMETRIE 66
2.10.2 STATISCHE LIBERATION 68
2.10.2.1 SCHEMATISCHER AUFBAU DER STATISCHEN LIBERATION 68
2.10.2.2 DURCHFUEHRUNG DER LIBERATION 69
2.10.2.2.1 STANDARDLIBERATIONSSYSTEM 69
2.10.2.2.2 LIBERATION MIT ZUSATZ EINES ENZYMEXTRAKTES AUS
MEERSCHWEINCHENLEBER 69
2.10.2.2.3 LIBERATION DER CHIMAERE HP14/30 70
2.10.3 BERECHNUNG DES QUELLUNGSVERMOEGENS
DER HYDROGELE 71
2.10.4 BESTIMMUNG DES
EROSIONSVERHALTENS DER FLUORESZENZMARKIERTEN
HYDROGELE 71
2.10.5 GEHALTSBESTIMMUNG DER GNRH-ANTAGONISTEN 72
6
INHALTSVERZEICHNIS
2.10.5.1 HOCHLEISTUNGSFLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE 72
2.10.5.2 PROTEINBESTIMMUNG 73
2.10.6 ATR-FTIR-SPEKTROSKOPIE 73
2.10.7 LICHTSTREUUNG 77
2.10.7.1 THEORETISCHER HINTERGRUND 77
2.10.7.2 DYNAMISCHE LICHTSTREUUNG 80
2.10.7.3 STATISCHE LICHTSTREUUNG 81
2.10.8 ZETAPOTENTIAL 81
2.10.9 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE (TEM) 82
2.10.10 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE (REM) 82
2.10.11 LYOPHILISATION 82
2.10.12 UEBERKRITISCHE TROCKNUNG 83
2.11 VERSUCHSAUSWERTUNG KOMPLEXLIBERATION, -QUELLUNG, -EROSION 83
3 ERGEBNISSE 84
3.1 GEWINNUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON NIEDERMOLEKULAREN CHITOSANEN...
84
3.1.1 PARTIALHYDROLYSE VON CHITOSAN IMW DURCH SALZSAEURE 84
3.1.1.1 BESTIMMUNG DER MITTLEREN MOLEKUELMASSEN DER HYDROLYSEFRAGMENTE 84
3.1.1.2 CHARAKTERISIERUNG DER CHITOSANHYDROLYSATE DURCH ATR-FTIR-
SPEKTROSKOPIE 87
3.1.2 PARTIALHYDROLYSE VON CHITOSAN IMW DURCH PHOSPHORSAEURE 88
3.1.2.1 BESTIMMUNG DER MITTLEREN MOLEKUELMASSEN DER HYDROLYSEFRAGMENTE 89
3.1.2.2 CHARAKTERISIERUNG DER CHITOSANHYDROLYSATE DURCH ATR-FTIR-
SPEKTROSKOPIE 91
3.2 ENTWICKLUNG UND CHARAKTERISIERUNG NEUER PEPTID-CHITOSAN-KOMPLEXE 91
3.2.1 DAS 2-KOMPONENTENSYSTEM GNRH-ANTAGONIST-CHITOSAN 91
3.2.1.1 BESTIMMUNG DER BELADUNGSEFFIZIENZEN DER GNRH-ANTAGONISTEN IM
KOMPLEX 91
3.2.1.2 CHARAKTERISIERUNG DER PEPTID-CHITOSAN-KOMPLEXE DURCH ATR-FTIR-
SPEKTROSKOPIE UND TEM 95
3.2.2 DAS SANDWICHSYSTEM GNRH-ANTAGONIST-MEDIATOR-CHITOSAN 98
3.2.2.1 CETRORELIX-POLYAMINOSAEURE-CHITOSAN-KOMPLEX 98
3.2.2.1.1 BESTIMMUNG DER BELADUNGSEFFIZIENZ VON CETRORELIX IM KOMPLEX 98
3.2.2.1.2 CHARAKTERISIERUNG DER CETRORELIX-CHITOSAN-KOMPLEXE DURCH
ATR-FTIR-
SPEKTROSKOPIE UND TEM 99
3.2.2.2 OZARELIX-POLYAMINOSAEURE-CHITOSAN-KOMPLEX 102
3.2.2.2.1 BESTIMMUNG DER BELADUNGSEFFIZIENZ VON OZARELIX IM KOMPLEX 102
7
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.2.2.2 CHARAKTERISIERUNG DER OZARELIX-CHITOSAN-KOMPLEXE DURCH
ATR-FTIR-
SPEKTROSKOPIE UND TEM 102
3.2.2.3 OZARELIX-HYDROXYCARBONSAEUREN-CHITOSAN-KOMPLEXE 104
3.2.2.3.1 BESTIMMUNG DER BELADUNGSEFFIZIENZ VON OZARELIX IM KOMPLEX 104
3.2.2.3.2 CHARAKTERISIERUNG DER OZARELIX-HCA-CHITOSAN-KOMPLEXE DURCH
ATR- FTIR-
SPEKTROSKOPIE UND TEM 107
3.2.3 DAS NANOSPHAERENSYSTEM CETRORELIX-MEDIATOR-CHITOSAN 109
3.2.3.1 MORPHOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DURCH ELEKTRONENMIKROSKOPIE 109
3.2.3.2 CHARAKTERISIERUNG DER NANOSPHAEREN DURCH ATR-FTIR-SPEKTROSKOPIE
....112
3.2.3.3 BESTIMMUNG DER GROESSENVERTEILUNG UND DIE ZETAPOTENTIALE DER
NANOSPHAEREN 113
3.2.3.4 BESTIMMUNG DER BELADUNGSEFFIZIENZ VON CETRORELIX IN DEN
NANOSPHAEREN
115
3.3 LIBERATIONSSTUDIEN DER ENTWICKELTEN PEPTID-PARTNER-KOMPLEXE 116
3.3.1 CETRORELIX-CHITOSAN-KOMPLEX (2-KOMPONENTENKOMPLEX) 116
3.3.1.1 LIBERATIONSVERHALTEN IN ABHAENGIGKEIT VON DER TROCKNUNGSART, DER
FREISETZUNGSTEMPERATUR UND DER MOLEKUELMASSE DER CHITOSANMATRIX 116
3.3.1.2 MATRIXABHAENGIGES QUELLUNGSVERHALTEN DER KOMPLEXE WAEHREND DER
LIBERATION 119
3.3.1.3 BESTIMMUNG DES FREISETZUNGSEXPONENTEN N 120
3.3.2 OZARELIX-CHITOSAN-KOMPLEX (2-KOMPONENTENKOMPLEX) 122
3.3.2.1 LIBERATIONSVERHALTEN IN ABHAENGIGKEIT VON DER TROCKNUNGSART, DER
FREISETZUNGSTEMPERATUR UND DER MOLEKUELMASSE DER CHITOSANMATRIX 122
3.3.2.2 MATRIXABHAENGIGES QUELLUNGSVERHALTEN DER KOMPLEXE WAEHREND DER
LIBERATION 124
3.3.2.3 BESTIMMUNG DES FREISETZUNGSEXPONENTEN N 125
3.3.3 CETRORELIX-MEDIATOR-CHITOSAN-KOMPLEX (SANDWICHKOMPLEX] 126
3.3.3.1 POLY
-L
-GLUTAMINSAEURE ALS ANIONISCHER MEDIATOR 126
3.3.3.1.1 LIBERATIONSVERHALTEN IN ABHAENGIGKEIT VON DER TROCKNUNGSART,
DER
FREISETZUNGSTEMPERATUR UND DER MOLEKUELMASSE DER CHITOSANMATRIX 126
3.3.3.1.2 MATRIXABHAENGIGES QUELLUNGSVERHALTEN DER KOMPLEXE WAEHREND DER
LIBERATION 128
3.3.3.1.3 BESTIMMUNG DES
FREISETZUNGSEXPONENTEN N 129
3.3.3.2 POLY
-DL
-ASPARAGINSAEURE ALS ANIONISCHER MEDIATOR 130
3.3.3.2.1 LIBERATIONSVERHALTEN IN ABHAENGIGKEIT VON DER TROCKNUNGSART,
DER
FREISETZUNGSTEMPERATUR UND DER MOLEKUELMASSE DER CHITOSANMATRIX 130
3.3.3.2.2 MATRIXABHAENGIGES QUELLUNGSVERHALTEN DER KOMPLEXE WAEHREND DER
LIBERATION 133
8
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.3.2.3 BESTIMMUNG DES FREISETZUNGSEXPONENTEN N 134
3.3.4 OZARELIX-MEDIATOR-CHITOSAN-KOMPLEX (SANDWICHKOMPLEX] 136
3.3.4.1 POLY
-DL
-ASPARAGINSAEURE ALS ANIONISCHER MEDIATOR 136
3.3.4.1.1 LIBERATIONSVERHALTEN IN ABHAENGIGKEIT VON DER TROCKNUNGSART,
DER
FREISETZUNGSTEMPERATUR UND DER MOLEKUELMASSE DER CHITOSANMATRIX 136
3.3.4.1.2 MATRIXABHAENGIGES QUELLUNGSVERHALTEN DER KOMPLEXE WAEHREND DER
LIBERATION 138
3.3.4.1.3 BESTIMMUNG DES
FREISETZUNGSEXPONENTEN N 140
3.3.4.2 HYDROXYCARBONSAEUREN ALS ANIONISCHE MEDIATOREN 141
3.3.4.2.1 LIBERATIONSVERHALTEN IN ABHAENGIGKEIT VON DER TROCKNUNGSART,
DER
FREISETZUNGSTEMPERATUR UND DER MOLEKUELMASSE DER CHITOSANMATRIX 141
3.3.4.2.2 MATRIXABHAENGIGES QUELLUNGSVERHALTEN DER KOMPLEXE WAEHREND DER
LIBERATION 145
3.3.4.2.3 BESTIMMUNG DES
FREISETZUNGSEXPONENTEN N 145
3.3.5 PH-WERT-ABHAENGIGES FREISETZUNGSVERHALTEN DER ENTWICKELTEN GNRH-
ANTAGONIST-KOMPLEXE 146
3.3.5.1 GNRH-ANTAGONIST-CHITOSAN-KOMPLEX (2-KOMPONENTENSYSTEM) 146
3.3.5.2 GNRH-ANTAGONIST-MEDIATOR-CHITOSAN-KOMPLEX (SANDWICHKOMPLEX) 151
3.3.5.2.1 CETRORELIX-POLY
-DL
-ASPARTAT-CHITOSAN-KOMPLEX 151
3.3.5.2.2 OZARELIX-POLY
-DL
-ASPARTAT-CHITOSAN-KOMPLEXE 154
3.4 NACHWEIS DES EROSIONSVERHALTENS DURCH FLUORESZENZ-MARKIERTES
CHITOSAN
IM GNRH-ANTAGONIST-KOMPLEX 156
3.4.1 SYNTHESE VON FLUORESZENZMARKIERTEM CHITOSAN 156
3.4.2 EROSIONSVERHALTEN VON REINEM CHITOSAN 157
3.4.3 UNTERSUCHUNG DES
EROSIONSVERHALTENS DER FLUORESZENZ-MARKIERTEN
CETRORELIX-KOMPLEXE 158
3.4.3.1 BELADUNGSEFFIZIENZEN VON CETRORELIX IM FLUORESZENZMARKIERTEN
KOMPLEX
158
3.4.3.2 EROSIONS- UND LIBERATIONSVERHALTEN DER FLUORESZENZMARKIERTEN
CETRORELIX-
KOMPLEXE 159
3.4.4 UNTERSUCHUNG DES
EROSIONSVERHALTENS DER OZARELIX-CHITOSAN-KOMPLEXE
162
3.4.4.1 BELADUNGSEFFIZIENZEN DER FLUORESZENZMARKIERTEN OZARELIX-KOMPLEXE
162
3.4.4.2 EROSIONS- UND LIBERATIONSVERHALTEN DER FLUORESZENZMARKIERTEN
OZARELIX-
KOMPLEXE 162
3.4.5 CETRORELIX-MEDIATOR-CHITOSAN-NANOSPHAEREN 166
3.4.5.1 UNTERSUCHUNG DES
FREISETZUNGSVERHALTENS IM STANDARD-LIBERATIONSSYSTEM
166
9
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.5.2 MATRIXABHAENGIGES QUELLUNGSVERHALTEN DER NANOSPHAEREN WAEHREND DER
LIBERATION 168
3.4.5.3 STABILITAETSUNTERSUCHUNGEN DER MIT CETRORELIX BELADENEN
NANOSPHAEREN
NACH ZUSATZ EINES ENZYMEXTRAKTES AUS MEERSCHWEINCHENLEBER 170
3.4.5.3.1 MATRIXABHAENGIGES QUELLUNGSVERHALTEN DER NANOSPHAEREN WAEHREND
DER
LIBERATION 171
3.4.5.3.2 NACHWEIS DER ENZYMATISCHEN DEGRADATION DER NANOSPHAEREN DURCH
VERWENDUNG VON FLUORESZENZMARKIERTEM CHITOSAN 172
3.4.5.4 BESTIMMUNG DES
FREISETZUNGSEXPONENTEN N 177
3.5 UEBERTRAGUNG DES KOMPLEXIERUNGSPRINZIPES DER GNRH-ANTAGONISTEN AUF
DIE
CHIMAERE HP14/30 178
3.5.1 KOMPLEXIERUNG DER CHIMAERE HP14/30 MIT CHITOSAN MMW 178
3.5.2 STATISCHE LIBERATION DER HP14/30-CHITOSAN-KOMPLEXE 179
3.5.3 ANWENDUNG DES CHIMAERE HP14/30-CHITOSAN MMW-KOMPLEXES IM
TIERMODELL 182
3.5.3.1 BESTIMMUNG DES SERUM-IG UND DES SEKRETORISCHEN IGA IN
ABHAENGIGKEIT
VON DER IMMUNISIERUNGSART 182
3.5.3.2 INFEKTIONSSTUDIE MIT M. PNEUMONIAE M129 185
3.5.3.2.1 BESTIMMUNG DER SERUM-LMMUNGLOBULINKLASSEN UND DES
SEKRETORISCHEN
IGA IN ABHAENGIGKEIT VON DER IMMUNISIERUNGSART 185
3.5.3.2.2 BESTIMMUNG DES SEKRETORISCHEN IGA AUF DER MUKOSA
UNTERSCHIEDLICHER
GEWEBE 186
3.5.3.2.3 BELASTUNG DES NASEN-
UND RACHENRAUMS UND DER LUNGE DURCH INFEKTION
MIT M. PNEUMONIAE 187
4 DISKUSSION 189
4.1 PARTIALHYDROLYSE UND CHARAKTERISIERUNG VON CHITOSAN IMW 189
4.1.1 PARTIALHYDROLYSE VON CHITOSAN IMW 189
4.1.2 EINFLUSS DES AGGREGATIONSVERHALTENS AUF
DIE BESTIMMUNG DER MITTLEREN
MOLEKUELMASSE HOCHMOLEKULARER CHITOSANE UND CHITOSANHYDROLYSATE 190
4.2 ENTWICKLUNG NEUER GNRH-ANTAGONIST-PARTNER-KOMPLEXE 193
4.2.1 KOMPLEXIERUNGSPOTENTIAL VON CHITOSAN FUER DIE GNRH-ANTAGONISTEN
CETRORELIX UND OZARELIX 194
4.2.1.1 GNRH-ANTAGONIST-CHITOSAN-KOMPLEXE (2-KOMPONENTENKOMPLEX) 194
4.2.1.2 GNRH-ANTAGONIST-POLYAMINOSAEURE-CHITOSAN-KOMPLEXE
(SANDWICHKOMPLEX) 196
4.2.1.3 OZARELIX-HYDROXYCARBONSAEURE-CHITOSAN-KOMPLEXE (SANDWICHKOMPLEX)
199
4.3 LIBERATIONSVERHALTEN DER KOMPLEXE MIT GNRH-ANTAGONISTEN 201
10
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.1 FREISETZUNGSVERHALTEN DER GNRH-ANTAGONIST-CHITOSAN-KOMPLEXE
(2-KOMPONENTENKOMPLEX) 201
4.3.2 FREISETZUNGSVERHALTEN DER
GNRH-ANTAGONIST-MEDIATOR-CHITOSAN-KOMPLEXE
(SANDWICHKOMPLEXE) 204
4.3.2.1 POLYAMINOSAEUREN ALS ANIONISCHE MEDIATOREN 204
4.3.2.2 HYDROXYCARBONSAEUREN ALS ANIONISCHE MEDIATOREN 206
4.4 CHITOSAN-POLYAMINOSAEURE-NANOSPHAEREN FUER DAS MODELLPEPTID CETRORELIX
208
4.4.1 SYNTHESE DER PEPTID-PAS-CHITOSAN-NANOSPHAEREN 209
4.4.1.1 UNBELADENE PAA-CHITOSAN-NANOSPHAEREN 209
4.4.1.2 MIT CETRORELIX BELADENE PAA-CHITOSAN-NANOSPHAEREN 209
4.4.2 FREISETZUNGSVERHALTEN IM STATISCHEN LIBERATIONSSYSTEM 214
4.4.3 MODELLUNTERSUCHUNGEN ZUR WIRKSTOFFFREISETZUNG VON CETRORELIX UNTER
EINFLUSS EINES ENZYMEXTRAKTES AUS MEERSCHWEINCHENLEBER 216
4.5 ENTWICKLUNG EINER METHODE ZUR UNTERSUCHUNG DES EROSIONSVERHALTENS
VON
CHITOSAN WAEHREND DER LIBERATION 218
4.5.1 SYNTHESE VON FLUORESZENZMARKIERTEM CHITOSAN 219
4.5.2 NACHWEIS DES EROSIONSVERHALTENS DER ENTWICKELTEN KOMPLEXSYSTEME
FUER
CETRORELIX UND OZARELIX 219
4.6 CHIMAERE HP14/30-CHITOSAN-KOMPLEXE 226
4.6.1 ANWENDUNG DER KOMPLEXIERUNGSSTRATEGIE DER GNRH-ANTAGONISTEN AUF
DIE
CHIMAERE HP14/30 226
4.6.2 FREISETZUNGSVERHALTEN DER CHIMAERE HP14/30 IM STATISCHEN
LIBERATIONSSYSTEM 227
4.6.3 POTENTIAL DER ENTWICKELTEN HYDROGELFORMULIERUNG FUER EINE
IMMUNISIERUNGSSTRATEGIE GEGEN MYCOPLASMA PNEUMONIAE 228
5 ZUSAMMENFASSUNG 231
LITERATURVERZEICHNIS 235
ANHANG 255
EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG 261
11
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