Heterologe Expression und Aufreinigung von humanen ABC-Transportern:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2014
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INHALT
INHALT
1 EINLEITUNG 1
1.1 ABC-TRANSPORTER 1
1.1.1 DIE STRUKTUR DER ABC-TRAUSPORTER 2
1.1.2 DER HALBTRANSPORTER ABCG2 4
1.1.3 DER VOLLTRANSPORTER ABCC11 9
1.1.4 TRANSPORTMECLIANISMEN DER ABC-TRANSPORTER 13
1.2 SYSTEME ZUR UNTERSUCHUNG VON ABC-TRANSPORTERN 17
1.3 SYSTEME ZUR HETEROLOGEN EXPRESSION VON ABC-TRANSPORTERN 19
1.3.1 DIE METHYLOTROPHE HEFE P. PASTORIS 21
2 ZIELSETZUNG 23
3 ERGEBNISSE 25
3.1 GENERIERIMG EINES EXPRESSIONSSYSTEMS FUER ABCG2 UND EYFP_ABCG2 2-5
3.2 HETEROLOGE EXPRESSION UND AUFREINIGUNG DER ABC-TRANSPORTER 30
3.2.1 KULTIVIERUNG DER HEFE P. PASTORIS ZUR PROTEINEXPRESSION 30
3.2.2 UNTERSUCHUNGEN HINSICHTLICH GEEIGNETER DETERGENZIEN ZUR SOLU-
BILISIERUNG DER ABC-TRANSPORTER 32
3.2.3 AUFREINIGUNG DER ABC-TRANSPORTER MITTELS AFFINITAETSCHROMATO
GRAPHIE 35
3.2.3.1 AUFREINIGUNG DER ABC-TRANSPORTER NACH SOLUBILISIERUNG
MIT DDM 37
3.2.3.2 AUFREINIGUNG DER ABC-TRANSPORTER UNTER DENATURIEREN
DEN BEDINGUNGEN 42
3.2.3.3 AUFREINIGUNG DER ABC-TRANSPORTER NACH SOLUBILISIERUNG
MIT FOS-CHOLIN-16 43
3.2.4 AUFREINIGUNG DER ABC-TRANSPORTER UEBER DIE DYE-LIGAND CHRO
MATOGRAPHIE 46
3.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTIONALITAET DER ABC-TRANSPORTER 52
3.3.1 TRANSPORFCMESSUNGEN AN ABCC11-WT GENOMEMBRANE VESI-
KELN 52
3.3.2 FUNKTIONALITAET VON ABCC11 IN DEN MEMBRANEN VON P. PASTORIS 53
3.3.3 ATPASE-AKTIVITAET DER AUFGEREINIGTEN ABC-TRANSPORTER 56
4 DISKUSSION 61
IX
HTTP://D-NB.INFO/1051701082
INHALT
4.1 DIE WAHL DES EXPRESSIONSSYSTEMS GL
4.2 DIE GENERIERUNG DES EXPRESSIONSSYSTEMS FUER ABCG2 UND EYFP_ABCG2 63
4.3 UEBERPRUEFUNG DES EXPRESSIONSSYSTEMS FUER ABCC11 66
4.4 KULTIVIERUNG VON P. PASTORIS IN EINER FED-BATCH FERMENTATION 68
4.5 AUFREINIGUNG DER ABC-TRANSPORTER 70
4.5.1 DETERGENZIEN-SCREENING 70
4.5.2 AUFREINIGUNG DER ABC-TRANSPORTER MITTELS TANDEMAFFINITAETSCHRO
MATOGRAPHIE 72
4.5.3 AUFREINIGUNG UEBER DIE DJ/E-LII/OND-CHROMATOGRAPHIE 77
4.0 DIE FUNKTIONALITAET DER AUFGEREINIGTEN ABC-TRANSPORTER 78
5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 85
6 MATERIAL UND METHODEN 89
6.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN 89
6.2 CHEMIKALIEN 90
6.3 GERAETE UND SPEZIELLE SOFTWARE 94
6.4 KULTURMEDIEN, PUFFER UND STAMMLOESUNGEN 95
6.4.1 PUFFER 95
6.4.2 STAMMLOESUNGEN 98
6.4.3 MEDIEN 99
6.5 GENERIERUNG DES EXPRESSIONSSYSTEMS FUER ABCG2 UND EYFP_ABCG2 . 99
6.5.1 KONSTRUKTION DER EXPRESSIONSVEKTOREN 100
6.5.2 MIKROBIOLOGISCHE ARBEITEN 101
6.5.2.1 GENOTYP DES VERWENDETEN E. COLI K12 STAMMES . 101
6.5.2.2 GENOTYP DES VERWENDETEN P. PASTORIS STAMMES . 101
6.5.2.3 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER E. COLI ZELLEN 101
6.5.2.4 TRANSFORMATION VON E. COLI ZELLEN 101
6.5.2.5 KULTIVIERUNG VON E.COLI ZELLEN 102
6.5.2.6 LAGERUNG VON E.COLI ZELLEN 102
6.5.2.7 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER P. PASTORIS ZELLEN . . . 102
6.5.2.8 TRANSFORMATION VON P. PASTORIS ZELLEN 102
6.5.2.9 KULTIVIERUNG UND LAGERUNG VON P. PASTORIS ZELLEN . . . 103
6.5.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN 103
6.5.3.1 AGAROSEGELELEKTROPHORESE VON DNA 103
6.5.3.2 QUANTIFIZIERUNG VON DNA 104
6.5.3.3 DNA-ISOLIERUNG AUS AGAROSEGELEN 104
6.5.3.4 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 104
6.5.3.5 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 104
X
INHALT
6.5.3.6 RESTRIKTION 105
6.5.3.7 LIGATION 108
6.5.3.8 SEQUENZIERUNG 108
6.5.4 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 108
6.6 EXPRESSION UND AUFREINIGUNG DER HUMANEN ABC-TRANSPORTER 109
6.6.1 KULTIVIERUNG VON P. PASTORIS IM GROSSMASSSTAB 109
6.6.2 PROTEINAUFREINIGUNG 111
6.6.2.1 ZELLAUFSCHLUSS UND ISOLATION VON PLASMANIEMBRANMIKRO-
SOMEN 112
6.6.2.2 HERSTELLUNG VON INSIDE-OUT VESIKELN 112
6.6.2.3 SOLUBILISIERUNG DER ABC-TRANSPORTER 113
6.6.2.4 NI-NTA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPLUEE 113
6.6.2.5 CBP-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 11C
6.6.2.6 STREP-TACTIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPLIIE 116
6.6.2.7 D?/E-LIGANC/-CHROMATOGRAPHIE 117
6.7 UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTIONALITAET 118
6.7.1 UNTERSUCHUNG DER ATPASE-AKTIVITAET 118
6.7.2 AUFNAHME VON
3
H- MARKIERTEN SUBSTRATEN IN VESIKEL 120
6.8 ALLGEMEINE PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 121
6.8.1 PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG 121
6.8.1.1 ABSORPTION BEI 280 UM 121
6.8.1.2 BRADFORD-TEST 121
6.8.1.3 BCA TEST 121
6.8.2 SDS-PAGE 122
6.8.3 WESTERN BLOT 123
6.8.4 IMNMNODETEKTION 123
6.8.5 SILBERFAERBUNG VON PROTEINEN NACH DER SDS-PAGE 124
7 LITERATURVERZEICHNIS 127
ANHANG 140
VEKTOREN 141
SEQUENZEN 144
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 160
TABELLENVERZEICHNIS 162
ABKUERZUNGEN 163
CURRICULUM VITAE 166
DANKSAGUNG 169
XI |
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