Untersuchungen zur Struktur und makromolekularen Organisation von Kollagen VI:
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| adam_text | Titel: Untersuchungen zur Struktur und makromolekularen Organisation von Kollagen VI
Autor: Maaß, Tobias Christian
Jahr: 2014
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis..........................................................................................................IV
1 Einleitung...............................................................................................................................1
1.1 Kollagene.........................................................................................................................1
1.1.1 Übersicht...................................................................................................................1
1.1.2 Kollagen VI...............................................................................................................4
1.1.3 Die „neuen Kollagen VI a-Ketten...........................................................................7
1.1.4 Interaktionen von Kollagen VI..................................................................................9
1.1.5 Medizinische Aspekte von Kollagen VI.................................................................10
1.1.5 Strukturuntersuchungen an Kollagen VI.................................................................14
1.2 Methoden zur Strukturaufklärung..................................................................................17
1.2.1 SAXS.......................................................................................................................17
1.2.2 Molekulare Elektronenmikroskopie........................................................................18
1.3 Ziel der Arbeit................................................................................................................19
2 Material und Methoden...............................................................................................
2.1 Material...................................................................................................................
2.1.1 Puffer.................................................................................................................
2.1.2 Molekulargewichtsstandards............................................................................
2.1.3 Vektoren............................................................................................................
2.1.4 Proteine.............................................................................................................
2.1.5 Antikörper.........................................................................................................
2.1.6 Oligonucleotide (Primer)..................................................................................
2.2 Methoden..................................................................................................................
2.2.1 Molekularbiologische Methoden.......................................................................
2.2.1.1 Polymerasekettenreaktion (PCR)...............................................................
2.2.1.2 Mutagenese-PCR........................................................................................
2.2.1.3 Agarosegelelektrophorese..........................................................................
2.2.1.4 Extraktion von DNA aus Agarosegelen und Aufreinigung aus Lösungen
2.2.1.5 Restriktionsverdau von DNA.....................................................................
2.2.1.6 Ligation von DNA......................................................................................
2.2.1.7 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse.................................................
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2.2.1.8 Herstellung transformationskompetenter Bakterien.........................................30
2.2.1.9 Transformation von Bakterien.........................................................................31
2.2.1.10 Konzentrationsbestimmung von DNA...........................................................31
2.2.1.11 Plasmid-DNA-Präparation aus Bakterien......................................................31
2.2.1.12 Klonierung von rekombinanten Proteinkonstrukten - Zusammenfassung.....32
2.2.2 Zellkulturarbeiten....................................................................................................33
2.2.2.1 Passagierung und Kultivierung von HEK-293-EBNA-Zellen.........................33
2.2.2.2 Kryokonservierung von Zellen.........................................................................33
2.2.2.3 Transfektion und Selektion von Zellen............................................................34
2.2.2.4 Ernte der Zellkulturüberstände.........................................................................34
2.2.3 Proteinbiochemische Methoden..............................................................................35
2.2.3.1 Affinitätsreinigung rekombinanter Proteine.....................................................35
2.2.3.2 Konzentrationsbestimmimg von Proteinen......................................................36
2.2.3.3 Dialyse..............................................................................................................37
2.2.3.4 Größenausschlusschromatographie..................................................................37
2.2.3.5 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE).......................................38
2.2.3.6 Coomassie-Färbung von Proteinen..................................................................39
2.2.3.7 Western Blot.....................................................................................................39
2.2.3.8 Sequenzanalyse von Proteinen mittels MALDI-TOF......................................40
2.2.3.9 Herstellung spezifischer Antikörpern...............................................................40
2.2.3.10 Titerbestimmung von Antikörpern.................................................................42
2.2.3.11 ELISA-ähnliche Bindungsstudien..................................................................43
2.2.3.12 Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie (SPR).................................44
2.2.3.13 Circulardichroismus (CD)-Spektroskopie......................................................45
2.3.4 Methoden zur Strukturaufklärung und Modellierungen..........................................46
2.3.4.1 Röntgenklein Winkelstreuung (Small Angle X-ray Scattering, S AXS).............46
2.3.4.2 Molekulare Elektronenmikroskopie.................................................................47
3 Ergebnisse............................................................................................................................49
3.1 Klonierung und Expression der kollagenartigen Kollagen VI -Domänen.....................50
3.2 Klonierung und Expression der nicht-kollagenen Kollagen VI -Domänen und
Generierung von Antikörpern........................................................................................53
3.3 Strukturmodelle der nicht-kollagenen Kollagen VI -Domänen.....................................58
3.4 Interaktionen zwischen nicht-kollagenen Kollagen VI -Fragmenten.............................67
3.5 Interaktionen von Kollagen VI mit anderen Proteinen..................................................69
3.5.1 Untersuchung von Interaktionen mit bekannten Bindungspartnern und Suche nach
neuen Bindungspartnern.........................................................................................69
3.5.2 Interaktion von Kollagen VI mit Nidogen..............................................................71
4 Diskussion............................................................................................................................79
4.1 Rekombinante Expression der kollagenen Domänen von Kollagen VI.........................79
4.2 Rekombinante Expression der nicht-kollagenen Domänen von Kollagen VI und
Generierung von spezifischen Antikörpern....................................................................83
4.3 Strukturuntersuchungen an nicht-kollagenen Domänen von Kollagen VI....................87
4.4 Interaktionen von nicht-kollagenen Domänen von Kollagen VI...................................90
4.5 Interaktionen von Kollagen VI mit anderen Proteinen..................................................92
4.6 Ausblick.........................................................................................................................95
5 Zusammenfassung...............................................................................................................97
6 Abstract................................................................................................................................99
7 Literaturverzeichnis..........................................................................................................101
Danksagung...........................................................................................................................111
Erklärung..............................................................................................................................112
Lebenslauf.............................................................................................................................113
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