Charakterisierung von RNA-Polymerase-Mutanten und von Transkriptionsfaktoren mit Hilfe des genetischen Systems von Pyrococcus furiosus:
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| adam_text | CHARAKTERISIERUNG VON RNA-POLYMERASE-MUTANTEN UND VON
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN MIT HILFE DES GENETISCHEN SYSTEMS VON
PYROCOCCUS FURIOSUS
DISSERTATION
ZUR
ERLANGUNG
DES
DOKTORGRADES
DER NATURWISSENSCHAFTEN
(DR. RER. NAT.) DER
FAKULTAET
FUER BIOLOGIE
UND
VORKLINISCHE
MEDIZIN
DER
UNIVERSITAET
REGENSBURG
VORGELEGT VON
INGRID WAEGE
AUS LANDSHUT
IM JAHR 2014
HTTP://D-NB.INFO/1056055294
INHALTSVERZEICHNIS
1. ALLGEMEINE EINLEITUNG 1
1.1. PYROCOCCUS FURIOSUS 1
1.2. STRATEGIEN FUER DIE GENETISCHE MANIPULATIONEN BEI ARCHAEEN 2
1.3. ZUCKERMETABOLISMUS IN P. FURIOSUS 10
1.4. TRANSKRIPTION BEI ARCHAEEN UND EUKARYOTEN 13
1.5. RNA-POLYMERASEN 17
1.6. MOTIVATION 19
2. DIE STRUKTUR-FUNKTIONS-ANALYSE BEI RPOA -MUTANTEN 21
2.1. EINLEITUNG 21
2.1.1. ETABLIERUNG DES SHUTTLE-VEKTOR-SYSTEMS, DER TRANSFORMATIONS- UND
SELEKTI
ONSSTRATEGIE 21
2.1.2. RPOA UND DIE RNA-POLYMERISATION 24
2.1.3. ZIELSETZUNG 26
2.2. MATERIALIEN UND METHODEN 27
2.2.1. BAKTERIEN-UND ARCHAEENSTAEMME 27
2.2.2. VERWENDETE PLASMIDE 28
2.2.3. PYS7 UND DESSEN DERIVATE PYS7 H87P UND PYS7 AUP 28
2.2.4. ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY 30
2.2.5. KALIUMPERMANGANAT-FOOTPRINTING 30
2.2.6. DNASE-FOOTPRINTING 33
2.2.7. ROHEXTRAKTE FUER PROTEOM-ANALYSE 34
2.3. ERGEBNISSE 35
2.3.1. REINIGUNG UND QUANTIFIZIERUNG DER RNAP-VARIANTEN 35
2.3.2. FUNKTIONSANALYSE DER MODIFIZIERTEN RPOA -RNAPS 38
2.3.3. ANALYSE DER P./URIOSUS-STAEMME 40
2.3.4. PF0739 43
2.4. DISKUSSION 48
3. CHARAKTERISIERUNG VON TRMBL2 53
3.1. EINLEITUNG 53
3.1.1. REGULATION DER TRANSKRIPTION BEI ARCHAEEN 53
3.1.2. DER TRANSKRIPTIONSREGULATOR TRMB 54
3.1.3. REGULATOREN DER TRMB-FAMILIE IN P. FITRIOSUS 56
VII
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.4. ZIELSETZUNG 58
3.2. MATERIAL UND METHODEN 58
3.2.1. BAKTERIEN-UND ARCHAEENSTAEMME 59
3.2.2. ERZEUGTE PLASMIDE 59
3.2.3. DNA-MANIPULATIONEN UND PLASMID-KONSTRUKTIONEN 59
3.2.4. RNA-EXPRESSIONSANALYSE 61
3.2.5. CHIP-SEQ 66
3.3. ERGEBNISSE 69
3.3.1. ETABLIERUNG DER TRMBL2
MODIFIZIERTEN P. FURIOSUS STAEMME MURPFOE UND MUR-
PFLO 69
3.3.2. IN VIVO CHARAKTERISIERUNG VON TRMBL2 72
3 .3.3. IN VITRO FUNKTIONSANALYSE VON TRMBL2 77
3.3.4. HITZESTABILIAET VON TRMBL2 81
3.4. DISKUSSION 84
4. GERICHTETE EVOLUTION EINER CHIMAEREN RPB5/RPOH-UNTEREINHEIT 89
4.1. EINLEITUNG 89
4.1.1. RPOHUNDRPB5 89
4.1.2. ZIELSETZIMG 94
4.2. MATERIALIEN UND METHODEN 94
4.2.1. BAKTERIEN-UND ARCHAEENSTAEMME 94
4.2.2. DNA-MANIPULATIONEN UND PLASMID-KONSTRUKTIONEN 95
4.3. ERGEBNISSE 98
4.3.1. ETABLIERUNG DER P. FIIRIOSUS RPOH-MUTANTEN 98
4.3.2. MURPF38 UND MURPF39 98
4.3.3. PMUR43 UND PMUR54 98
4.3.4. VITALITAET DER P. FIIRIOSUS RPOH-MUTANTEN 99
4.3.5. AKTIVITAET DER MODIFIZIERTEN RNAP 101
4.4. DISKUSSION 102
5. OPTIMIERUNG DES CHITINSTOFFWECHSELS 105
5.1. EINLEITUNG 105
5.1.1. CHITIN UND CHITINASEN 105
5.1.2. DIE MARKERLOSE SELEKTIONS-STRATEGIE 107
5.2. MATERIAL UND METHODEN 109
5.2.1. BAKTERIEN-UND ARCHAEENSTAEMME 109
5.2.2. ERZEUGTE PLASMIDE 109
5.2.3. CHEMIKALIEN 110
5.2.4. KULTIVIERUNG VON P. FIIRIOSUS UND T. KODAKARENSIS 110
5.2.5. DURCHFUEHRUNG DER SELEKTIONS- UND GEGENSELEKTIONSSTRATEGIE 112
5.2.6. DNA-MANIPULATIONEN UND PLASMID-KONSTRUKTIONEN 113
VIII
INHALTSVERZEICHNIS
5.3. ERGEBNISSE 119
5.3.1. P. FURIOSUS MLAPF1950 (MURPF27) 119
5.3.2. MODIFIKATIONEN DER CHITINASE-EINHEITEN 122
5.3.3. UNTERSUCHUNGEN DES CHITIN-ABBAUS 125
5.4. DISKUSSION 128
6. ALLGEMEINE DISKUSSION 131
6.1. ERFAHRUNGSBERICHTE - GRENZEN UND MOEGLICHKEITEN DER GENETISCHEN
HILFSMITTEL .... 132
6.1.1. DER EXPRESSIONSVEKTOR 132
6.1.2. DIE SIMVASTATIN SELEKTION 135
6.1.3. DAS MARKERLOSE SIMVASTATIN-XGPRT-SYSTEM 137
6.2. AUSBLICK 141
7. ZUSAMMENFASSUNG 143
8. SUMMARY 145
ANHANG I
1. STANDARD-METHODEN UND MATERIALIEN I
1.1. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN I
1.2. PROTEINBIOCHEMISCHE VERFAHREN VIII
1.3. ORGANISMISCHE METHODEN XII
1.4. CHEMIKALIEN XVI
1.5. ENZYME, STANDARDS, KITS XVIII
2. ABKUERZUNGEN XVIII
2.1. ALLGEMEINE ABKUERZUNGEN XVIII
2.2. BUCHSTABENCODE DER AMINOSAEUREN XXII
ABBILDUNGSVERZEICHNIS XXIII
TABELLENVERZEICHNIS XXVII
PUBLIKATIONEN XXIX
ERKLAERUNG XXXI
DANKSAGUNG XXXIII
IX
|
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