Die Charakterisierung myeloider Suppressorzellen im Modell der experimentellen Leishmaniose:
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| adam_text | AUS DEM INSTITUT FUER IMMUNOLOGIE
FRAU PROFESSOR DR. D. MAENNEL
DER FAKULTAET FUER MEDIZIN
DER UNIVERSITAET REGENSBURG
DIE CHARAKTERISIERUNG MYELOIDER SUPPRESSORZELLEN IM
MODELL DER EXPERIMENTELLEN LEISHMANIOSE
INAUGURAL - DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER BIOMEDIZINISCHEN WISSENSCHAFTEN
- DR. RER. PHYSIOL. -
DER
FAKULTAET FUER MEDIZIN
DER UNIVERSITAET REGENSBURG
VORGELEGT VON
MAXIMILIAN SCHMID
DEZEMBER 2013
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 DAS ANGEBORENE IMMUNSYSTEM 1
1.2 DAS ADAPTIVE IMMUNSYSTEM 2
1.3 DAS MONONUKLEAERE PHAGOZYTEN-SYSTEM (MPS) 3
1.4 DIE CHEMOKINE UND CHEMOKIN-REZEPTOREN 5
1.4.1 MONOZYTEN UND DER CHEMOKIN-REZEPLOR CCR2 6
1.5 MYELOIDE SUPPRESSORZELLEN 7
1.5.1 MOLEKULARE MECHANISMEN DER SUPPRESSION 9
1.5.2 MYELOIDE SUPPRESSORZELLEN BEI WEITEREN KRANKHEITSBILDERN 10
1.6 DIE LEISHMANIOSE 11
1.6.1 TAXONOMIE 11
1.6.2 LEBENSZYKLUS DER LEISHMANIEN 12
1.6.3 DIE LEISHMANIOSE DES MENSCHEN 14
1.6.4 DAS EXPERIMENTELLE MODELL DER LEISHMANIOSE IN DER MAUS 15
1.6.5 DIE IMMUNANTWORT GEGEN LEISHMANIA MAJOR 17
1.7 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 19
2. MATERIAL UND METHODEN 21
2.1 MATERIAL 21
2.1.1 LABORGERAETE 21
2.1.2 CHEMIKALIEN, REAGENZIEN UND LOESUNGEN 22
2.1.3 MEDIUM UND PUFTER 24
2.1.4 ANTIKOERPER 25
2.1.5 OLIGONUKLEOTIDE 26
2.1.6 GLAS- UND PLASTIKMATERIALIEN 27
2.1.7 MAUSLINIEN 28
2.1.8 LEISHMANIEN-STAMM 28
2.1.9 SOFTWARE 29
2.2 METHODEN 30
2.2.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 30
2.2.1.1 HERSTELLUNG VON BLUTAGARPLATTEN FUER DIE LEISHMANIENKULTUR 30
2.2.1.2 LEISHMANIENKULTUR 30
2.2.1.3 HERSTELLUNG VON LEISHMANIENANTIGEN (SLA) 31
2.2.1.4 BLUTENTNAHME UND HERSTELLUNG VON SEREN 31
2.2.1.5 HERSTELLUNG EINER POLVKLONALEN ANTI-SLA-LGG-FRAKTION 31
2.2.1.6 ZELLZAEHLUNG 32
2.2.1.7 ISOLIERUNG VON ZELLEN AUS DEM KNOCHENMARK, MILZ UND
LYMPHKNOTEN 32
2.2.1.8 ISOLIERUNG VON ZELLEN AUS DEM FUSSGEWEBE 33
2.2.1.9 HERSTELLUNG VON GM-CSF-HALTIGEM ZELLKULTURUEBERSTAND 33
2.2.1.10 GENERIERUNG VON KNOCHENMARK-DENDRITISCHEN ZELLEN (BMDC)
UND IN VITRO MYELOIDEN SUPPRESSORZELLEN (MDSC) 33
2.2.1.11 DURCHFLUSSZYTOMETRIE (FACS) 34
2.2.1.12 ZELLSEPARATION MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE (FACSARIA) 36
2.2.1.13 MAGNETISCHE ZELLSEPARATION (MACS =
MAGNEIIC ACTIVATED
CELL SORTING) 36
2.2.1.14 ERAYME-IINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY (ELISA) 37
2.2.1.15 IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG 38
2.2.1.16 CFSE-MARKIERUNG VON L. MAJOR ODER T ZELLEN 38
2.2.1.17 GENERIERUNG VON PERITONEAL EXUDAT MAKROPHAGEN (PERITONEAL
EXUDATE CELLS = PECS) 39
2.2.1.18 LEISHMANIEN-SPEZIFISCHER T-ZELL SUPPRESSIONSASSAY 39
2.2.1.19 NITRITNACHWEIS IN ZELLKULTUR-UBERSTAENDEN (GRIESS-REAKTION) 41
2.2.2 TIERVERSUCHE 41
2.2.2.1 INFEKTION MIT L. MAJOR, FUBDICKENMESSUNG UND DTH-REAKTION 41
2.2.2.2 GEMCITABIN BEHANDLUNG VON MAEUSEN 42
2.2.2.3 NACHWEIS DER ZELLPROLIFERATION IN VIVO MITTELS BRDU 42
2.2.2.4 GENERIERUNG VON KNOCHENMARK-CHIMAEREN MAEUSEN
(CCR2
+
WT) 42
2.2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 44
2.2.3.1 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS ORGANEN 44
2.2.3.2 RNA ISOLIERUNG AUS IN VITRO ZELLKULTUREN 44
2.2.3.3 REVERSE TRANSKRIPTION VON RNA 45
2.2.3.4 QRT-PCR ZUM NACHWEIS VON INOS, ARGINASE-1 UND IDO MRNA .... 45
2.2.3.5 QRT-PCR ZUR BESTIMMUNG DER PARASITENLAST IN ORGANEN 47
2.3 STATISTIK 48
3. ERGEBNISSE 49
3.1 CHARAKTERISIERUNG VON MDSCS IN NAIVEN C57BL/6- UND BALB/C-MAEUSEN 49
3.1.1 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSE VON KNOCHENMARK, BLUT, MILZ,
POPLITEALEN LYMPHKNOTEN UND FUSSGEWEBE 49
3.1.2 HISTOLOGISCHE ANALYSE VON POPLITEALEN LYMPHKNOTEN AUS C57BL/6- UND
BALB/C-MAEUSEN 52
3.2 IN VITRO CHARAKTERISIERUNG VON MDSCS IN DER LEISHMANIOSE 54
3.2.1 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSE VON IN VITRO GENERIERTEN MDSCS 54
3.2.2 KO-KULTUR VON CFSE-MARKIERTEN L. MAJOR MIT IN VITRO GENERIERTEN
MDSCS 55
3.2.3 INOS UND ARGINASE-1 EXPRESSION VON IN VITRO GENERIERTEN MDSCS 58
3.2.3.1 INOS UND ARGINASE-1 EXPRESSION WAEHREND DER DIFFERENZIERUNG
MIT GM-CSF 58
3.2.3.2 INOS UND ARGINASE-1 EXPRESSION WAEHREND L. MAJOR KO-KULTUR 58
3.2.3.3 ARGINASE-1 UND INOS EXPRESSION IN MO-MDSCS 60
3.2.4 LEISHMANIENANTIGEN-SPEZIFISCHER SUPPRESSIONSASSAY MIT IN VITRO
GENERIERTEN MDSCS 61
3.2.4.1 EINFLUSS AUF DIE FUNKTIONALITAET VON IN VITRO GENERIERTEN MDSCS
DURCH L. MAJOR 61
3.2.4.2 EINFLUSS AUF DIE FUNKTIONALITAET VON IN VITRO GENERIERTEN MDSCS
DURCH DIFFERENZIERUNG MIT ALL
-IRANS
RETINSAEURE (ATRA) 63
3.2.4.3 EINFLUSS AUF DIE FUNKTIONALITAET VON IN VITRO GENERIERTEN MDSCS
DURCH
ARGINASE-1- UND INOS-INHIBITOREN 66
3.3 IN VIVO CHARAKTERISIERUNG VON MDSCS IN DER LEISHMANIOSE 68
3.3.1 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSE VON KNOCHENMARK, BLUT, MILZ,
POPLITEALEN LYMPHKNOTEN UND FUSSGEWEBE 10 TAGE NACH L. MAJOR
INFEKTION... 68
3.3.2 IN VIVO DETEKTION VON PROLIFERIERENDEN MYELOIDEN ZELLEN WAEHREND
EINER
L. MAJOR INFEKTION 71
3.3.3 DEPLETION MYELOIDER ZELLEN MIT GEMCITABIN WAEHREND EINER L. MAJOR
INFEKTION 73
3.4 DIE BEDEUTUNG VON CCR2 FUER DAS .HOMING VON MDSCS 75
3.4.1 DIE EXPRESSION VON CCR2 AUF DER ZELLOBERFLAECHE VON MDSCS 75
3.4.2 DER VERLAUF EINER LEISHMANIOSE IN CCR2 MAEUSEN 76
3.4.3 UNTERSUCHUNG VON KNOCHENMARK-CHIMAEREN WAEHREND EINER LEISHMANIEN-
INFEKTION (CCR2 WT) 80
4. DISKUSSION 86
4.1 IN VITRO CHARAKTERISIERUNG VON MDSCS IN DER LEISHMANIOSE 87
4.2 IN VIVO CHARAKTERISIERUNG VON MDSCS IN DER LEISHMANIOSE 90
5. ZUSAMMENFASSUNG 95
6. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 97
7. LITERATURVERZEICHNIS 100
8. ANHANG 108
9. DANKSAGUNG 110
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