Small interfering RNA vermittelte Suppression der Adhäsionsmoleküle E-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1 zum Schutz endothelialer Zellen der Vena saphena magna vor pathophysiologischer Leukozyteninfiltration:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2014
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 THEMATISCHE EINFUEHRUNG 1
1.2 DAS POSTPERFUSIONSSYNDROM (PPS) 4
1.3 DAS
SYSTEMIC INFLAMMATORY RESPONSE SYNDROME
(SIRS). 5
1.3.1 DEFINITION 5
1.3.2 DIE ROLLE DER LEUKOZYTEN 6
1.3.3 PATHOMECHANISMUS 6
1.4 RESTENOSE EINGESETZTER ALLOGRAFTS. 8
1.5 ENSTEHUNGSMECHANISMEN DER INTIMAHYPERPLASIE 9
1.5.1 DIE ROLLE DER THROMBOZYTEN 10
1.5.2 LEUKOZYTENADHAERENZ UND INFILTRATION 10
1.5.3 BETEILIGUNG VON SMOOTH MUSCLE CELLS (SMC). 12
1.5.4 AKTIVIERUNG DER GERINNUNGSKASKADE 13
1.6 DAS ENDOTHEL. 13
1.7 DIE RESPONSE TO INJURY HYPOTHESE. 15
1.8 PROINFLAMMATORISCHE ZYTOKINE. 16
1.9 ENDOTHELIALE ADHAESIONSMOLEKUELE 17
1.9.1 SELEKTINE 18
1.9.2 INTEGRINE 19
1.9.3 PROTEINE DER IMMUNGLOBULIN-GRUPPE 20
1.9.4 CADHERINE 21
1.10 MECHANISMEN DER ENDOTHELIALEN LEUKOZYTENINFILTRATION 22
1.10.1 ROLLING .22
1.10.2 TETHERING 22
1.10.3 STICKING .23
1.10.4 MIGRATION .23
1.11 METHODEN ZUR GEZIELTEN AUSSCHALTUNG VON GENEN 24
1.12 SMALL INTERFERING RIBONUCLEIC ACIDS (SIRNA) 26
1.12.1 FUNKTIONSMECHANISMUS .26
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1.12.2 ANWENDUNG IN SAEUGETIERZELLEN
1.12.3 ZELLULARE AUFNAHME
1.13 ZIELSETZUNG
29
29
32
2 MATERIAL UND METHODEN. .33
2.1 MATERIAL 33
2.1.1 ANTIKOERPER. 33
2.1.2 SIRNA .34
2.1.3 REAGENZIEN 36
2.1.4 GERAETE. 38
2.1.5 SOFTWARE .40
2.1.6 ZELLEN 40
2.2 METHODEN 40
2.2.1 ISOLIERUNG VON HUMAN VENOUS ENDOTHELIAL CELLS (HVEC) 40
2.2.2 MARKIERUNG VON HVEC MIT CD31 .41
2.2.3 KULTIVIERUNG VON HVEC .41
2.2.4 TRANSFEKTION VON HVEC .43
2.2.5 EFFIZIENZ UNTERSCHIEDLICHER TRANSFEKTIONSREAGENZIEN .44
2.2.6 DESIGN DER SIRNA SEQUENZEN .45
2.2.7 HYBRIDISIERUNG DER SIRNA. .48
2.2.8 ERMITTLUNG DER OPTIMALEN
TNF-A AKTIVIERUNGSDAUER .48
2.2.9 ERMITTLUNG DER OPTIMALEN TNF-A KONZENTRATION .48
2.2.10 TITRATION DER ANTIKOERPER .49
2.2.11 ANTIKOERPER FUER DIE FACS-ANALYSE 49
2.2.12 VORBEREITUNG DER ZELLEN FUER DIE FACS-ANALYSE. 49
2.2.13 MESSUNG DER ERGEBNISSE 50
2.2.14 AUSBILDUNG VON ICAM-1 AUF ENDOTHELIALEN ZELLEN 50
2.2.15 UNTERSUCHUNG DER SIRNA AUFNAHME 50
2.2.16 DIE REAL-TIME (RT)-PCR. 51
2.2.17 DER WESTERN BLOT. 52
2.2.18 ANWENDUNG DER SIRNA ICAM-1 AN DERMALEN MIKROVASKULAEREN
ENDOTHELZELLEN 52
3 ERGEBNISSE. 54
3.1 MARKIERUNG DER ISOLIERTEN HVEC MIT CD31 54
3.2 MYKOPLASMENFREIHEIT DER EINGESETZTEN ZELLEN 55
3.3 TRANSAKTION DER HVEC DER VENA SAPHENA MAGNA 56
3.3.1 EFFIZIENZ DER GETESTETEN TRANSFEKTIONSREAGENZIEN 59
3.3.2 SIRNA SEQUENZEN ICAM-1, E-SELEKTIN, VCAM-1 59
3.3.3 UNTERSUCHUNG DER SIRNA AUFNAHME 63
3.4 TNF-A AKTIVIERUNGSDAUER; 63
3.4.1 ICAM-1 63
3.4.2 E-SELEKTIN 63
3.4.3 VCAM-1 64
3.5 TNF-A KONZENTRATION 65
3.5.1 ICAM-1 65
3.5.2 E-SELEKTIN 66
3.5.3 VCAM-1 67
3.6 AUSBILDUNG VON ICAM-1 AUF ENDOTHELIALEN ZELLEN 68
3.7 SUPPRESSION DER REZEPTORAUSBILDUNG 68
3.7.1 ICAM-1 68
3.7.2 E-SELEKTIN 71
3.7.3 VCAM-1 73
3.13 EVALUIERUNG DER FACS-ERGEBNISSE DURCH RT-PCR 75
3.14 EVALUIERUNG DER FACS-ERGEBNISSE MIT HILFE DES WESTERN-BLOTTING
__77
3.15 ANWENDUNG DER SIRNA ICAM-1 AN DERMALEN
MIKROVASKULAEREN ENDOTHELZELLEN 79
4 DISKUSSION .80
4.1 BISHERIGE THERAPIEANSAETZE_
.81
4.2 DER EINSATZ VON SIRNA 84
4.3 ENDOTHELZELLEN DER VENA SAPHENA MAGNA 87
4.3.1 ZELLKULTUR 87
4.3.2 AKTIVIERUNG .88
4.3.3 TRANSFEKTION 93
4.4 TRANSFEKTION DER HVEC MIT SPEZIFISCHER SIRNA 96
4.5 MESSUNG DER ERGEBNISSE 100
* 4.5.1 DIE FACS-ANALYSE 100
4.5.2 DIE QUANTITAIVE REAL-TIME-PCR (QRT-PCR) 103
4.5.3 DER WESTERN BLOT 104
4.6 DISKUSSION DER ERGEBNISSE 106
4.7 AUSBLICK; 107
5 ZUSAMMENFASSUNG 111
6 VERZEICHNIS DER ABKUERZUNGEN 113
7 LITERATUR 118
8 DANKSAGUNG.
138
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