MeCAT-IA - ein neuartiges Reagenz zur molekular- und elementmassenspektrometrischen Quantifizierung von Proteinen:
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Berlin
2013
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INHALT
DANKSAGUNG 1
ZUSAMMENFASSUNG 2
INHALT 5
1. EINLEITUNG UND AKTUELLER KENNTNISSTAND 8
1.1 DIE PROTEOMFORSCHUNG UND METALLMARKIERUNG VON PROTEINEN 8
DAS PROTEOM - EINE ANALYTISCHE HERAUSFORDERUNG 8
PROTEINQUANTIFIZIERUNG MITTELS MASSENSPEKTROMETRIE 9
METALLCHELATKOMPLEXE FUER DIE ABSOLUTE PROTEINQUANTIFIZIERUNG 12
1.2 MARKIERUNG VON PROTEINEN 14
CHEMIE DER PROTEINMARKIERUNG 14
MULTIMETALL-MARKIERUNGEN 18
WAHL DER LANTHANOIDE 19
EINFLUSS DER MARKIERUNGSCHEMIE AUF DIE PROTEINANALYSE 19
1.3 SELEKTIVITAET IN KOMPLEXEN MATRICES UND KOPPLUNG MIT ICP-MS 21
PROTEINTRENNUNG 21
TRENNUNG VON PEPTIDEN 24
KOPPLUNG ZWISCHEN LC UND ICP-MS 24
AFFINITAETSAUFREINIGUNG 25
1.4 KALIBRIERUNG 26
EXTERNE KALIBRIERUNG 26
INTERNE STANDARDS 27
1.5 IDENTIFIZIERUNG VON MARKIERTEN PROTEINEN 29
1.6 SCHLUSSFOLGERUNGEN AUS DEM BISHERIGEN KENNTNISSTAND FUER DIE WEITERE
FORSCHUNGSARBEIT
DIESER ARBEIT 32
2. ERGEBNISSE 33
2.1 DARSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON MECAT-IA 33
2.2 OPTIMIERUNG DER PROTEINMARKIERUNG MIT MECAT-IA 37
BESTAETIGUNG DER VOLLSTAENDIGEN MARKIERUNG 38
2.3 MOEGLICHKEITEN DER IDENTIFIZIERUNG VON MECAT-IA-MARKIERTEN PROTEINEN
44
MOEGLICHKEITEN DER IDENTIFIZIERUNG VON MARKIERTEN PROTEINEN MITTELS
DATENBANKSUCHE 49
MOEGLICHKEITEN DER IDENTIFIZIERUNGEN MIT MALDI-MS 50
FRAGMENTIERUNG VON MARKIERTEN PROTEINEN 52
2.4 STABILITAET VON LN-MECAT-IA 53
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2.5 ETABLIERUNG VON METHODEN ZUR RELATIVEN PROTEINQUANTIFIZIERUNG
MITTELS MECAT-IA 55
NANOHPLC/ESI-MS-ANALYSE 57
NANOHPLC/ESI-MS/MS-ANALYSE 58
HPLC/ICP-MS-ANALYSE 60
ICP-MS-ANALYSE DER MINERALISIERTEN GELBANDEN 60
VERGLEICH DER METHODEN 60
SOFTWAREGESTUETZTE AUSWERTUNG VON ESI-MS-DATEN ZUR RELATIVEN
QUANTIFIZIERUNG 61
2.6 ANWENDUNG UND VERGLEICH VON METHODEN ZUR PROTEINQUANTIFIZIERUNG
ANHAND DER
BESTIMMUNG VON HUMANEM SERUMALBUMIN (HSA) IN BLUTSERUM 69
MALDI-MS 71
NANOHPLC/ESI-MS UND -MS/MS-ANALYSEN 71
HPLC/ICP-MS 72
ESI-MS/MS DER PROTEINMISCHUNGEN 73
ICP-MS DER MINERALISIERTEN GELBANDEN 74
ERGEBNISSE DER HSA-QUANTIFIZIERUNGEN UND VERGLEICH DER METHODEN 74
3. DISKUSSION UND AUSBLICK 78
3.1 DIE MECAT-BASIERTE PROTEINQUANTIFIZIERUNGSSTRATEGIE 79
FORTSCHRITTE UND PERSPEKTIVEN BEI DER MARKIERUNG 79
FORTSCHRITTE UND PERSPEKTIVEN BEI DER IDENTIFIZIERUNG MARKIERTER
PROTEINE 81
METHODENENTWICKLUNG ZUR RELATIVEN QUANTIFIZIERUNG UND ANWENDUNG 82
3.2 BILDGEBENDE MASSENSPEKTROMETRIE MIT MECAT 82
3.3 SUBSTRATSCREENING 85
3.4 WEITERE PERSPEKTIVEN UND ABSCHLUSSBEMERKUNGEN 87
4. MATERIALIEN UND METHODEN 89
SYNTHESE VON /V-SUCCINIMIDYLIODACETAT (SIA) 91
SYNTHESE DES MECAT-IA-GRUNDKOERPERS AUS S-2-(4-AMINOBENZYL)-L,4,7,10-
TETRAAZACYCLODODECANTETRAESSIGSAEURE UND METALLIERUNG 91
AUFREINIGUNG DES METALLIERTEN MECAT-IA 91
STABILITAETSUNTERSUCHUNGEN VON TB-MECAT-IA 92
PROTEINMARKIERUNG MIT LN-MECAT-IA 92
PEPTIDMARKIERUNG MIT LN-MECAT-IA 93
ENTSALZEN VON PROBEN 93
PROTEOLYSE IN LOESUNG 93
GELELEKTROPHORESE 93
ANALYSE VON REDUZIERTEN UND MARKIERTEN PROTEINEN MITTELS HPLC/ESI-MS UND
-MS/MS 94
DIREKTE ICP-MS-ANALYSE VON GELBANDEN 95
PROTEOLYSE IM GEL 95
NANOHPLC/ESI-MS- UND -MS/MS-ANALYSE 96
SOFTWARE-GESTUETZTE AUSWERTUNG VON ESI-MS-DATEN ZUR RELATIVEN
QUANTIFIZIERUNG 96
MALDI-MS-ANALYSE UND MALDI-MS-LMAGING 97
PHOTOMETRISCHE PROTEINBESTIMMUNG 98
QUANTIFIZIERUNG HSA IN BLUTSERUM 98
LITERATURVERZEICHNIS 99
ANHANG 106
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 117 |
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