Funktionelle Analyse von CEACAM20, einem epithelialen Rezeptor mit antiadhäsiven Eigenschaften:
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 ROLLE DER ADHAESION BEI
ENTSTEHUNG EPITHELIALER TUMORE 1
1.2 BEDEUTUNG DER TUMORMARKER 1
1.2.1 DAS MAGENKARZINOM 3
1.3 DIE CEA-FAMILIE 3
1.3.1 DIE CEACAMS DES MENSCHEN 4
1.3.1.1 FUNKTION UND FUNKTIONSORTE
DER CEACAMS 6
1.3.2 PSG-SUBGRUPPE 9
1.4 ITAM-VERMITTELTE SIGNALTRANSDUKTION 10
1.5 AKTUELLER WISSENSSTAND ZU CEACAM20 12
1.6 ZIELSETZUNG DER DISSERTATION 14
2 MATERIALIEN 15
2.1 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 15
2.2 ENZYME UND KITS 16
2.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN 17
2.4 GERAETE 17
2.5 ANTIKOERPER 18
2.6 OLIGONUKLEOTIDE 19
2.7 BAKTERIEN 19
2.8 ZELLLINIEN 19
2.9 GEWEBE 19
2.10RNA 20
2.11
VERWENDETE VEKTOREN 20
2.12SOFTWARE UND INTEMETADRESSEN 20
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INHALTSVERZEICHNIS
II
3 METHODEN 21
3.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 21
3.1.1 DNA-AGAROSEGELELEKTROPHORESE 21
3.1.2 DNA-EXTRAKTION AUS AGAROSEGELEN 21
3.1.3 DNA-VERDAU MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 22
3.1.4 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA 23
3.1.5 AUFREINIGUNG VON DNA 23
3.1.6 LIGATION 23
3.1.7 TRANSFORMATION KOMPETENTER BAKTERIEN 24
3.1.8 KOLONIE-POLYMERASE-KETTENREAKTION 24
3.1.9 PLASMIDPRAEPARATION 25
3.1.10 HERSTELLUNG VON E.-CO//-DAUERKULTUREN 26
3.1.11 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG UND REINHEIT
DER DNA 26
3.1.12 DNA-SEQUENZIERUNG 26
3.1.13 GENERIERUNG VON GLATTEN
DNA-ENDEN MITTELS
KLENOW-POLYMERASE 27
3.1.14 INDUZIERBARE EXPRESSION MIT DEM TET-ON-EXPRESSIONSVEKTOR
PRTS 27
3.1.14.1 KLONIERUNG DER CEACAM20-CDNA IN PRTS 28
3.1.15 GEZIELTES EINFUEHREN VON MUTATIONEN MITTELS
PCR 30
3.1.16 RNA-ISOLIERUNG UND
QUALITAETSMESSUNG 32
3.1.17 REVERSE TRANSKRIPTION VON
RNA 33
3.1.18 F?EA/-F;ME-POLYMERSASE-KETTENREAKTION (RT-PCR) 34
3.2 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 34
3.2.1 KULTIVIERUNG VON ZELLEN 34
3.2.2 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 35
3.2.3 AUFTAUEN UND EINFRIEREN VON ZELLEN 35
3.2.4 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON
KULTURZELLEN 36
3.2.5 STABILE TRANSFEKTION VON KULTURZELLEN 36
3.2.6 PERVANANDAT-BEHANDLUNG VON KULTURZELLEN 37
3.2.7 LYSE DER ZELLEN 37
3.2.8 PROTEINBESTIMMUNG 38
3.2.9 ERSTELLUNG EINER WACHSTUMSKURVE VON STABIL
TRANSFIZIERTEN KULTURZELLEN 38
3.2.10 ZELL-VITALITAETSASSAY 38
3.2.11 HERSTELLUNG VON ZYTOSPINS 39
3.3 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 40
3.3.1 IMMUNHISTOLOGIE 40
3.3.2 ZELLBASIERTER ELISA (CELISA) 41
3.3.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 42
3.3.4 IMMUNPRAEZIPITATION 43
3.3.5 AUFTRENNUNG VON PROTEINPROBEN
IM GRADIENTENGEL 44
3.3.6 PROTEINANALYSE IM WESTERN BLOT 44
3.3.7 PROBENVORBEREITUNG FUER DIE
MASSENSPEKTROMETRIE 45
INHALTSVERZEICHNIS
III
4 ERGEBNISSE 48
4.1 EXPRESSIONSORTE VON CEACAM20 48
4.1.1 EXPRESSION VON CEACAM20
IN NORMALEM MAGENGEWEBE,
MAGENKARZINOMEN UND
MAGENKARZINOMZELLLINIEN DES MENSCHEN 48
4.1.1.1 QUANTITATIVER NACHWEIS VON CEACAM20-MRNA IN
MAGENKARZINOMGEWEBE UND ZUGEHOERIGEN
NORMALMAGENGEWEBE MITTELS
REAL-TIME-PCB 48
4.1.2 UNTERSUCHUNG DES EXPRESSIONSMUSTERS VON
CEACAM20 IN MAGENKARZINOM-
UND NORMALEM MAGENGEWEBE AUF PROTEINEBENE 50
4.1.2.1 UNTERSUCHUNG DER ANTIKOERPERSPEZIFITAET 50
4.1.2.2 CEACAM20-PROTEINNACHWEIS IN MAGENKARZINOMGEWEBE 52
4.1.2.3 EXPRESSION VON CEACAM20
IM OVAR 53
4.2 FUNKTIONSANALYSEN VON CEACAM20 56
4.2.1 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG
VON STABILEN INDUZIERBAREN CEACAM20-
EXPRIMIERENDENTRANSFEKTANTEN 56
4.2.1.1 KLONIERUNG DER CEACAM20-CDNA IN PRTS 56
4.2.1.2 SCREENING DER ZELLKLONE AUF INDUZIERBARKEIT UND CEACAM20-
EXPRESSION MITTELS CELISA 56
4.2.2 CHARAKTERISIERUNG AUSGEWAEHLTER STABIL TRANSFIZIERTER
ZELL-KLONE AUF
INDUZIERBARKEIT UND
CEACAM20-EXPRESSION 57
4.2.2.1 DURCHFLUSSZYTOMETRIE (FACS) 57
4.2.2.2 WESTERN BLOT 58
4.2.2.3 CEACAM20 BEEINTRAECHTIGT DIE VITALITAET VON HEK293T-ZELLEN 60
4.2.2.4 HEMMUNG DER ZELLVITALITAET UND
ZELLPROLIFERATION WIRD NICHT DURCH
DIE
ZYTOPLASMATISCHE DOMAENE VERMITTELT 61
4.2.2.5 HERSTELLUNG VON ZYTOPLASMATISCHEN MUTANTEN 61
4.2.2.6 EINFLUSS VON CEACAM20-MUTANTEN AUF DIE ZELLVITALITAET 63
4.2.2.7 EINFLUSS VON CEACAM20 AUF DIE ZELLPROLIFERATION 65
4.2.2.8 VERLUST VON ADHAESION DURCH CEACAM20-EXPRESSION 66
4.2.3 IST DIE ITAM-KONSENSUSSEQUENZ VON CEACAM20
FUNKTIONELL? 68
4.2.3.1 KOENNEN DIE ZYTOPLASMATISCHEN
TYROSINE IN CEACAM20
PHOSPHORYLIERT
WERDEN? 68
4.2.3.2 QUANTIFIZIERUNG VON SYK-MRNA IN HUMANEN MAGENZELLLINIEN MITTELS
REAL-TIME-PCR 70
4.2.3.3 IDENTIFIZIERUNG MOEGLICHER BINDEPARTNER DES ZYTOPLASMATISCHEN
BEREICHS
VON CEACAM20 DURCH
DIE MASSENSPEKTROMETRIE 70
5 DISKUSSION 73
5.1 UEBEREXPRESSION VON CEACAM20 FUEHRT
IN VITRO ZU ADHAERENZVERLUST 73
5.2 HEMMUNG DER ZELL-ZELL-INTERAKTION DURCH
CEACAM20 74
5.3 FUNKTIONALITAET DES ITAM-MOTIVS 75
INHALTSVERZEICHNIS IV
5.4 MOEGLICHE ITAM-FUNKTION 76
5.5 IDENTIFIZIERUNG MOEGLICHER DOWNSTREAM-PARTNER VON CEACAM20 77
5.6 PROLIN-REICHE MOTIVE IN DER ZYTOPLASMATISCHEN
DOMAENE VON CEACAM20 KOENNEN
AN DER REGULATION DER
ZELLADHAESION BETEILIGT SEIN 79
5.7 IST CEACAM 3 MIT SEINEM ITAM ODER CEACAM1
MIT SEINEM INHIBITORISCHEN
ITIM-MOTIV EIN KOOPERATIONSPARTNER
VON CEACAM20? 81
5.8 EXPRESSION UND FUNKTION VON
CEACAM20 IN HUMANEM GEWEBE 82
6 ZUSAMMENFASSUNG 85
7 LITERATURVERZEICHNIS 86
8 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 102
9 DANKSAGUNG 104
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