Untersuchungen zur Stabilisierung und Interaktion von Cetuximab mit nicht-ionischen Tensiden:
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2013
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1 EINLEITUNG 1
1.1 DEFINITION UND EIGENSCHAFTEN VON TENSIDEN 1
1.2 PHARMAZEUTISCHER GINSATZ VON TENSIDEN IN PARENTERALEN FORMULIE
RUNGEN 2
1.3 STABILISIERUNG VON PARENTERALEN PROTEINFORMULIERUNGEN DURCH TENSIDE
6
1.3.1 KONKURRENZ ZWISCHEN PROTEINEN UND TENSIDEN UM GRENZ
FLAECHEN 7
1.3.2 DIREKTE TENSID - PROTEIN INTERAKTIONEN 10
1.4 TENSIDE ALS STABILISATOREN IN HOCHKONZENTRIERTEN ANTIKOERPERFORMU
LIERUNGEN 12
1.5 DESTABILISIERUNG VON PROTEINEN DURCH TENSIDE 14
2 ZIELSETZUNG 17
3 MATERIAL UND METHODEN 19
3.1 MATERIAL 19
3.1.1 MATERIAL, HILFSSTOFFE. REAGENZIEN 19
3.1.2 MODELLPROTEINE 22
3.1.2.1 CETUXIMAB - ERBITUX 22
3.1.2.2 BOVINES SERUM ALBUMIN (BSA) 23
3.2 METHODEN 24
3.2.1 PROBENHERSTELLUNG 24
3.2.1.1 TANGENTIALFLUSSFILTRATION 24
3.2.1.2 AEKTACROSSFLOW 25
3.2.1.3 PROBENHERSTELLUNG UND PROBENABFUELLUNG 25
3.2.1.4 LYOPHILISATEN 26
3.2.1.5 FUNKTIONALISIERUNG VON POLYSORBAT 80 27
3.2.2 STRESSMETHODEN 27
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INHALTSVERZEICHNIS
3.2.2.1 SCHUETTELSTRESS 27
3.2.2.2 TEMPERATURSTRESS 28
3.2.2.3 UV-STRESS 28
3.2.3 ANALYTISCHE METHODEN 28
3.2.3.1 GROEKENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAFIE (SEC) 28
3.2.3.2 BESTIMMUNG DES PROTEINGEHALTES 29
3.2.3.3 LICHTBLOCKADEMESSUNGEN 29
3.2.3.4 DYNAMISCHE LICHTSTREUUNG (DLS) 29
3.2.3.5 VISUELLE KONTROLLE 30
3.2.3.6 TRUEBUNGSMESSUNG 30
3.2.3.7 SDS-PAGE 30
3.2.3.8 UMKEHRPHASEN-HOCHLEISTUNGSFLUESSIGKEITSCHROMATO-
GRAPHIE (RP-HPLC) 31
3.2.3.9 UMKEHRPHASEN-HOCHLEISTUNGSFLUESSIGKEITSCHROMATO-
GRAPHIE-MASSENSPEKTROMETRIE (RP-HPLC/MS) . . 31
3.2.3.10 FOURIER-TRANSFORM-INFRAROT-SPEKTROSKOPIE (FT-IR) 32
3.2.3.11 //DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRIE (/IDSC) ... 32
3.2.3.12 NDIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRIE (NDSC).... 33
3.2.3.13 BESTIMMUNG DER PEROXIDZAHL 33
3.2.3.14 ISOTHEREME TITRATIONSKALORIMETRIE (ITC) 33
3.2.3.15 OBERFLAECHEN-PLASMON-RESONANZ (SPR) 34
3.2.3.16 ULTRASCHALL RESONATOR TECHNOLOGIE (URT) 35
3.2.3.17 RHEOMETRIE 35-
3.2.3.18 OBERFLAECHENSPANNUNGSMESSUNGEN 35
4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 36
4.1 MACHBARKEITSSTUDIE: AUFKONZENTRIERUNG VON CETUXIMAB 36
4.1.1 AUFKONZENTRIERUNG VON CETUXIMAB MITTELS ULTRAFILTRATION . 37
4.1.1.1 OPTIMIERUNG DES TFF PROZESSES MIT HILFE DER AEKTA-
CROSSFLOW 37
4.1.1.2 OPTIMIERUNG DER TTF-BEDINGUNGEN FUER CETUXI
MAB MIT HILFE DER AEKTACROSSFLOW 39
4.1.1.3 VERGLEICHENDER FILTRATIONSTEST AUF MILLIPORE LAB-
SCALE -ANLAGE UND AEKTACROSSFLOW 43
VII
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.1.4 EINFLUSS VON PH UND NACL KONZENTRATION AUF DEN
TFF-PROZESS 48
4.1.1.5 EVALUIERUNG DER MAXIMALEN ERREICHBAREN AUFKON
ZENTRIERUNG VON CETUXIMAB MITTELS TFF 51
4.1.2 AUFKONZENTRIERUNG VON CETUXIMAB MITTELS LYOPHILISATEN . 55
4.1.2.1 ERMITTLUNG DER OPTIMALEN SACCHAROSEKONZENTRATI
ON FUER DIE GEFRIERTROCKNUNG 56
4.1.2.2 LYOPHILISATION UND ANSCHLIESSENDE REKONSTITUTION
MIT WENIGER FLUESSIGKEIT 63
4.1.3 AUFKONZENTRIERUNG DURCH PARTIELLE LYOPHILISATION 66
4.1.3.1 BESTIMMUNG DER SUBLIMATIONSRATE VON WASSER AUS
LYOGUARD CONTAINERN 68
4.1.3.2 AUFKONZENTRIERUNG VON CETUXIMAB IN LYOGUARD
CONTAINERN 69
4.1.4 VERGLEICH DER DREI UNTERSUCHTEN AUFKONZENTRIERUNGSMETHODEN 73
4.2 EINFLUSS VON TENSIDEN AUF DIE STABILITAET VON CETUXIMAB 77
4.2.1 STRESSSTUDIEN 77
4.2.1.1 EINFLUSS VON CETUXIMAB- UND TENSIDKONZENTRATI-
ON AUF DIE PROTEINSTABILITAET WAEHREND AGITATION . . 78
4.2.1.2 EINFLUSS DER ANTIKOERPER- UND DER POLYSORBATKON-
ZENTRATION AUF DIE STABILITAET WAEHREND LAGERUNG
BEI ERHOEHTER TEMPERATUR 90
4.2.1.3 UNTERSUCHUNG DES EFFEKTES UNTERSCHIEDLICHER POLY-
SORBATQUALITAETEN AUF DIE LAGERSTABILITAET DES ANTI
KOERPERS BEI ERHOEHTEN TEMPERATUREN 99
4.2.1.4 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION 104
4.2.2 INTERAKTIONSSTUDIEN 106
4.2.2.1 CMC-BESTIMMUNG VON POLYSORBAT 80 IN CETUXI-
MABFORMULIERUNGEN 106
4.2.2.2 ISOTHERME TITRATIONS CALORIMETRIE (ITC) ZUR UN
TERSUCHUNG VON PROTEIN-TENSID INTERAKTIONEN . . . 109
4.2.2.3 OBERFLAECHENPLASMONRESONANZ (SPR) ALS TOOL FUER
DIE INTERAKTIONSDETEKTION ZWISCHEN PROTEINEN UND
TENSIDEN 116
VIII
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.2.4 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION 133
5 ZUSAMMENFASSUNG 135
LITERATURVERZEICHNIS 138
IX
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