Genetische Transformation und Regeneration von Hopfen (Humulus lupulus L.):
Gespeichert in:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Göttingen
Cuvillier
2003
|
| Ausgabe: | 1. Aufl. |
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zsfassung in engl. Sprache |
| Beschreibung: | XII, 137 S. Ill., graph. Darst. |
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| adam_text | Titel: Genetische Transformation und Regeneration von Hopfen (Humulus lupulus L.)
Autor: Horlemann, Christoph
Jahr: 2003
Inhaltsverzeichnis
Tabellenverzeichnis.................................................................................................VII
Abbildungsverzeichnis..............................................................................................K
Abkürzungsverzeichnis.............................................................................................XI
1. Einleitung..................................................................................................................1
1.1. Problemstellung.................................................................................................1
1.2. Ziel der Arbeit....................................................................................................6
1.3. Forschungsstand.................................................................................................6
2. Material und Methoden.............................................................................................9
2.1. Material.............................................................................................................9
2.1.1. Pflanzenmaterial...............................................................................................9
2.1.2. Bakterienstämme............................................................................................10
2.1.3. Chemikalien...................................................................................................10
2.1.4. Nukleinsäuren................................................................................................12
2.1.4.1. Nukleinsäuren allgemein.................................................................12
2.1.4.2. Plasmide...........................................................................................12
2.1.4.3. Nukleotide.......................................................................................13
2.1.4.4. 01igonukleoride(PCR-Primer)......................................................13
2.1.5. Enzyme...........................................................................................................15
2.1.6. Gebrauchtsfertige Reaktionssysteme (Kits)....................................................15
2.1.7. Verbrauchsmaterial.........................................................................................16
2.1.8. Gewächshausbedarf........................................................................................16
2.1.9. Geräte.............................................................................................................17
2.1.10. Software..........................................................................................................18
2.2. Methoden.........................................................................................................18
2.2.1. Pflanzenanzucht im Gewächshaus.................................................................18
2.2.2. Überführung von Hopfen in die Sterilkultur................................................18
2.2.3. Regeneration von Pflanzen aus Stängelstücken.............................................19
2.2.4. Herstellung von Konstrukten für die Transformation..................................20
Inhaltsverzeichnis
2.2.4.1. Herstellung und Klonierung eines binären Konstruktes
mit dem Gen NPR1.........................................................................20
2.2.4.2. Herstellung und Klonierung eines binären Konstruktes
mit dem Gen Stilbensynthase.........................................................23
2.2.4.3. Herstellung und Klonierung eines binären Konstruktes
mit dem Gen T4-Lysozym................................................................23
2.2.5. Genetische Transformation von Hopfen.......................................................24
2.2.5.1. Verwendete A. rume/ariero-Stämme und Konstrukte.......................24
2.2.5.2. Anzucht von A. twmefaciens für die Transformation........................24
2.2.5.3. Transformation und Cokultur von Hopfen
mitA. tumefaciens.............................................................................25
2.2.5.4. Sprossbildung und Selektion transformierter Explantate..............26
2.2.5.5. Regeneration transgener Hopfenpflanzen......................................26
2.2.5.6. In planta-Transformation von Hopfen.............................................27
2.2.6. Analyse der transgenen Pflanzen...................................................................27
2.2.6.1. Methoden zur möglichst frühen DNA-Extraktion von
potentiell transgenen Pflanzen........................................................27
2.2.6.2. Polymerasekettenreaktion (PCR).....................................................29
2.2.6.3. Southern-Hybridisierung.................................................................29
2.2.6.4. GUS-Enzymtest................................................................................30
2.2.7. Versuche zur Kultivierung des Pathogens Pseudoperonospma humuli
(Miy. . Takah.) G.Wils.................................................................................30
2.2.8. Amplifizierung einer zu NPR1 homologen Sequenz aus Hopfen..................30
2.2.9. Standardmethoden.........................................................................................31
2.2.9.1. Bereitung von Medien für die Gewebekultur.................................31
2.2.9.2. DNA-Isolierung...............................................................................32
2.2.9.3. Qualitätskontrollen der DNA-Extraktion.......................................33
2.2.9.4. Aufreinigung von DNA-Fragmenten...............................................33
2.2.9.5. Agarose-Gelelektrophorese..............................................................33
2.2.9.6. Restriktionsverdau...........................................................................34
2.2.9.7. Polymerasekettenreaktion (PCR).....................................................34
2.2.9.8. Transformation von E. coli...............................................................37
2.2.9.9. Transformation von A. tumtfaäens..................................................38
2.2.9.10. DNA-Sequenzierung........................................................................38
2.2.9.1t. DNA-Sequenzanalyse.......................................................................38
Inhaltsverzeichnis___________________________________________________________________1U
3. Ergebnisse.........................................................................,......................................39
3.1. Etablierung einer Sterilkultur von Hopfen........................................................39
3.1.1. Genotypische Unterschiede bei der Inkulturnahme
von Hopfenstecklingen..................................................................................39
3.1.2. Einfluss verschiedener Medienzusammensetzungen auf das
Wachstum von Propagationsstecklingen........................................................39
3.1.3. Ausfälle innerhalb der Propagation durch „Ausbleichen der Kulturen.......41
3.2. Entwicklung einer Methode zur Regeneration von Hopfen...............................43
3.2.1. Einfluss unterschiedlicher Explantattypen auf die Kallusbildung................43
3.2.2. Sprossbildung bei Stängelstücken von Gewächshausmaterial.......................44
3.2.3. Vergleich der Sprossindikrion aus Stängelstücken von
Gewächshaus- und in titro-Material................................................................45
3.2.4. Einfluss der Phytohormone TDZ und IAA auf die Sprossinduktion
aus in t itro-Material.........................................................................................46
3.2.5. Übersicht der Regeneration von Sprossen zu adulten Pflanzen...................48
3.3. Etablierung eines Transformationssystems für Hopfen......................................50
3.3.1. Transformation von Stängelstücken und Herstellung transgener Kalli........50
3.3.2. Herstellung und Analyse von transgenem Hopfen........................................50
3.3.2.1. Transformation und Regeneration transgener Pflanzen.................50
3.3.2.2. Nachweis der erfolgreichen Übertragung des Transgens................53
3.3.2.3. Nachweis der Expression des Transgens durch
GUS-Enzym tests..............................................................................55
3.3.3. In piantfl-Transformation von Meristemen.....................................................56
3.4. Optimierung des Transformationssystems.........................................................56
3.4.1. Ermittlung der optimalen Selektionsbedingungen.......................................56
3.4.M. Einfluss von Kanamycin auf die Gewebekultur von Hopfen.........56
3.4.1.2. Einfluss von Cefotaxim auf die Gewebekultur von Hopfen..........58
3.4.1.3. Einfluss von Timentin auf die Gewebekultur von Hopfen............60
3.4.2. Einfluss verschiedener Parameter auf die Sprossinduktion
innerhalb der Transformation.......................................................................60
3.4.2.1. Einfluss der Vorkultur der Explantate und des Explantattyps
auf die Sprossinduktion...................................................................61
3.4.2.2. Einfluss der Anzuchtbedingungen von A. tumefaciens....................61
3.4.2.3. Einfluss der Vakuunimfiltrarion.....................................................63
3.4.2.4. Einfluss von SihvetL77...................................................................63
JV Inhaltsverzeichnis
3.4.2.5. Einfluss der Cokulairbedingungen................................................64
3.4.2.6. Einfluss des zwischenzeitlichen Transfers auf neues
Selektionsmedium...........................................................................65
3.4.3. Sprossinduktion innerhalb der Transformation unter optimierten
im Vergleich zu nicht optimierten Bedingungen...........................................66
3.5. Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhter Widerstandskraft
gegen Pathogene...............................................................................................68
3.5.1. Herstellung geeigneter Konstrukte zur Erhöhung
der Widerstandskraft.....................................................................................69
3.5.2. Transformation mit Genen zur Erhöhung der Widerstandskraft.................74
3.5.3. Untersuchung der regenerierten, potentiell transgenen Pflanzen.................74
3.5.3.1. DNA-Extraktionsmethoden für die möglichst frühe
PCR-Analyse von transformierten Pflanzen....................................74
3.5.3.2. Nachweis des Transgens durch Triplex-PCR...................................75
3.5.4. Vergleich verschiedener Methoden zur Kultivierung des Pathogens
Pseudoperonospora Kumuli (Miy. Takah.) G. Wils.........................................78
4. Diskussion................................................................................................................81
4.1. Vergleich der Regenerationssysteme für Hopfen................................................81
4.2. Vergleich der Transformationssysteme für Hopfen............................................83
4.3. Optimierung der A. tume/aciens-vermittelten Transformation von Hopfen..........85
4.4. In pianta-Transformation bei Hopfen.................................................................89
4.5. Transformation von Hopfen zur Erhöhung der Widerstandskraft
gegen Pathogene...............................................................................................90
4.6. Resistenztests zur Untersuchung transgener Pflanzen.......................................94
4.7. Ausblick...........................................................................................................95
5. Zusammenfassung....................................................................................................97
6. Summary.................................................................................................................99
7. Literatur.................................................................................................................101
Inhaltsverzeichnis
8. Anhang...................................................................................................................117
8.1. Multiple alignment der über „blastn gefundenen homologen Sequenzen.......117
8.2. Ergebnis des Homologievergleiches der aus Hopfen klonierten
Sequenz mit „blastp .......................................................................................118
8.3. Multiple alignment der über „blastp gefundenen homologen Sequenzen.......118
8.4. Restriktionskarte des Plasmids pMPB 1-28.....................................................119
8.5. Sequenz von pMPB 1-28..................................................................................120
8.6. Restriktionskarte des Plasmids pMPBll-6......................................................123
8.7. Sequenz von pMPBll-6..................................................................................124
8.8. Sequenzen der Konstrukte zur Erhöhung der Resistenz..................................129
8.8.1. Sequenz des Konstruktes mit NPRJ (pMPB 11-6NPR1).............................130
8.8.2. Sequenz des Konstruktes mit Stilbensynthase (pMPB ll-6Stisy)................132
8.8.3. Sequenz des Konstruktes mit T4-Lysozym(pMPB ll-6Lys)..........................133
Danksagung............................................................................................................135
Curriculum vitae....................................................................................................137
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Bedeutung und Bekämpfung der wichtigsten Krankheiten und
Schädlinge des Hopfens..........................................................................................3
Tabelle 2: Liste aller verwendeten Primer..............................................................................14
Tabelle 3: Liste aller verwendeten Medien für die Gewebekultur........................................31
Tabelle 4: Liste der verwendeten PCR-Programme...............................................................35
Tabelle 5: Liste der Reaktionsbedingungen der verwendeten PCR-Programme..................36
Tabelle 6: Einfluss verschiedener Medienzusammensetzungen auf das Wachstum
von Propagationsstecklingen.................................................................................40
Tabelle 7: Untersuchung von Hopfen auf Befall verschiedener Viren.................................43
Tabelle 8: Einfluss des Explantattyps auf das Kalluswachstum............................................44
Tabelle 9: Sprossbildung bei Stängelsrücken aus Gewächshausmaterial..............................44
Tabelle 10: Vergleich Sprossbildung aus Stängelsrücken von Gewächshaus-
und in vitTo-Kultur-Material...................................................................................46
Tabelle 11: Einfluss der Phytohormone TDZ und IAA auf die Sprossbildung
aus Stängelstücken................................................................................................46
Tabelle 12: Transformation von Stängelstücken und Herstellung transgener Kalli...............51
Tabelle 13: Effizienz der Hopfentransformation.....................................................................52
Tabelle 14: Einfluss von Vorkultur und Explantattyp auf die Sprossinduktion
innerhalb der Transformation...............................................................................61
Tabelle 15: Anzucht von A. tumefixciens in Cokulturmedium zusammen
mit Hopfenexplan taten.........................................................................................62
Tabelle 16: Einfluss der Induktion von A. tumefociero auf die Sprossindukrion
innerhalb der Transformation..............................................................................62
Tabelle 17: Einfluss der Vakuuminfiltration auf die Sprossinduktion...................................63
Tabelle 18: Einfluss von Silwet L77 bei der Väkuuminfiltrarion auf
die Sprossindukrion..............................................................................................63
VHI Tabellenverzeichnis
Tabelle 19: Einfluss von Acetosyringon im Cokulturmedium auf
die Sprossinduktion innerhalb der Transformation............................................64
Tabelle 20: Einfluss der Temperatur während der Cokulrur auf
die Sprossinduktion innerhalb der Transformation............................................65
Tabelle 21: Transfer der Stängelstücke auf frisches Selektionsmedium
3 Wochennach der Transformation....................................................................65
Tabelle 22: Vergleich der Sprossinduktion unter optimierten und
nicht optimierten Bedingungen...........................................................................68
Tabelle 23: Untersuchung der zu NPR1 homologen Sequenz aus Hopfen
mit Hilfe von „blastn ...........................................................................................73
Tabelle 24: Transformation von Hopfen mit den Genen NPR1 und Stilbensynthase...........74
Tabelle 25: Anwendbarkeit von DNA-Extraktionsmethoden für das frühe
PCR-Sreening von regenerierten potentiell transgenen Pflanzen........................76
Tabelle 26: Vergleich der Regenerationssysteme für die Genotypen des
Saazer Formenkreis................................................................................................81
Tabelle 27: Vergleich der bisher veröffentlichten Arbeiten zur Transformation
von Hopfen...........................................................................................................84
Tabelle 28: Veröffentlichungen zu mit Stilbensynthase transformierten Pflanzen, die
verwendeten Pflanzenarten und die Pathogene, gegen die eine erhöhte
Resistenz festgestellt werden konnte.....................................................................92
Tabelle 29: Veröffentlichungen zu NPRl-transgenen Pflanzen, die verwendeten
Pflanzenarten und die Pathogene, gegen die eine erhöhte Resistenz
festgestellt werden konnte.....................................................................................93
Tabelle 30: Untersuchung der zu NPR1 homologen Sequenz aus Hopfen
mit Hilfe von blastp.............................................................................................118
JX
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: weibliche und männliche Blütenstände des Hopfens.....................................2
Abbildung 2: Schneiden von Stecklingen............................................................................19
Abbildung 3.- Monierung von NPR1 und Vstl (Stilbensynthase).......................................21
Abbildung 4: Entfernung des Startcodons am Ende des Translational leader...................23
Abbildung 5: Einfluss der Vitaminmischung im Grundmedium auf die
Propagation von Stecklingen.........................................................................41
Abbildung 6: Normal wachsende im Vereleich 2u ausgeblichenen
Propagationskulturen....................................................................................42
Abbildung 7: Bildung von grünem Kallus an Stängelstücken aus
Gewächshausmaterial....................................................................................45
Abbildung 8: Sprossentwicklung innerhalb der Hopfenregeneration................................47
Abbildung 9: Schema der Hopfenregeneration...................................................................49
Abbildung 10: Regeneration von Hopfen.............................................................................49
Abbildung 11: Transformation von Stängelstücken aus Gewächshausmaterial....................51
Abbildung 12: GUS-Enzymtest von Teilen potentiell rransgener Pflanzen
innerhalb der Regneration............................................................................52
Abbildung 13: Untersuchung der potentiell transgenen Pflanzen durch Triplex-PCR........54
Abbildung 14: GUS-Enzymtest von transgenen Pflanzen.....................................................55
Abbildung 15: Einfluss von Kanamycin auf Propagation und Sprossinduktion..................57
Abbildung 16: Einfluss von Cefotaxim auf Propation und Sprossinduktion.......................58
Abbildung 17: Einfluss von Cefotaxim auf die Sprossinduktion.........................................59
Abbildung 18: Vergleich aller zur Erhöhung der Transfonnationseffuienz
untersuchten Faktoren...................................................................................66
Abbildung 19: Vergleich der Transformarionseffizienz unter optimierten und
nicht optimierten Bedingungen....................................................................67
Abbildung 20: Au/bau der (w die Hopfentransformation hergestellten Konstrukte...........69
X Abbildungsverzeichnis
Abbildung 21: Deletion von 81 bp in den hergestellten Stilbensynthase-Konstrukten........70
Abbildung 22: Deletion einer einreinen Base in den hergestellten
T4-Lysozym-Konstruken.................................................................................71
Abbildung 23: Identifizierung einer zu NPR1 homologen Sequenz aus Hopfen.................72
Abbildung 24: Untersuchung der potentiell Stilbensynthase- oder NPR 1-transgenen
Pflanzen durch Triplex PCR mit npt/I-spezifischen Primern........................77
Abbildung 25: Untersuchung der transgenen Pflanzen mit Stilbensynthase-
spezifischen Primern......................................................................................78
Abbildung 26: In vitro-Kultivierung von Pseudoperonospma humuli
(Miy. Takah.) G. Wils....................................................................................79
Abbildung 27: Biosynthese von Resveratrol..........................................................................92
Abbildung 28: Multiple Augment der über blastn gefundenen homologen Sequenzen ...117
Abbildung 29: Multiple Aligment der über blastp gefundenen homologen Sequenzen ....118
Abbildung 30: Restriktionskarte von pMPB 1-28.................................................................119
Abbildung 31: Restriktionskarte von pMPBll-6.................................................................123
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