Lentivirale Vektoren und RNAi für den Einsatz in der Xenotransplantation:
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
ERKLAERUNG 2
DANKSAGUNG 3
ABKUERZUNGEN 7
ZIELSETZUNG DER ARBEIT 12
1. EINLEITUNG 13
1.1. LENTIVIREN 13
1.2. ENTWICKLUNG LENTIVIRALER VEKTOREN 17
1.3. RNAI UND SHRNA 18
1.4. XENOTRANSPLANTATION 20
1.5. A-L,3-GALAKTOSYLTRANSFERASE 21
1.6. MULTITRANSGENE LENTIVIRALE VEKTOREN 22
1.7. GENERIERUNG TRANSGENER
SCHWEINE 23
2. MATERIAL UND METHODEN 25
2.1. CHEMIKALIEN UND LOESUNGEN 25
2.2. GERAETE 25
2.3. DESIGN DER SHORT HAIRPIN OLIGONUKLEOTIDE 26
2.3.1. ERMITTLUNG DER SEKUNDAERSTRUKTUR 26
2.3.2. SIRNA DESIGN 26
2.3.3. SHRNA DESIGN 27
2.4. MOLEKULARBIOLOGISCHE KLONIERUNGS-METHODEN 27
2.4.1. ANNEALING VON SHRNA OLIGONUKLEOTIDEN 27
2.4.2. PHOSPHORYLIERUNG VON SHRNA OLIGONUKLEOTIDEN 28
2.4.3. RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA 28
2.4.4. DEPHOSPHORYLIERUNG VON PLASMID-DNA 28
2.4.5. AUFFULLEN VON DNA-ENDEN NACH RESTRIKTIONSVERDAU 29
2.4.6. AGAROSE GELELEKTROPHORESE 29
2.4.7. DNA-EXTRAKTION AUS AGAROSEGELEN 30
2.4.8. LIGATION 30
2.4.9. HERSTELLUNG
CHEMISCH KOMPETENTER E.COLI XL-1 BLUE 31
2.4.10. TRANSFORMATION IN CHEMISCH KOMPETENTE E.COLI XL-1 BLUE 31
2.4.11. PLASMID-DNA MINIPRAEPARATION *. 32
2.4.12. PLASMID-DNA MAXIPRAEPARATION 32
2.4.13. AMPLIFIKATIONS PCR 33
2.4.14. SEMIQUANTITATIVE PCR 34
2.4.15. SEQUENZIERUNG 34
2.5. SHUTTLEPLASMIDE UND VIRUSPLASMIDE 35
2.6. KLONIERUNG SHRNA-CODIERENDER VIRUSPLASMIDE 35
2.7. KLONIERUNG
MULTITRANSGENER VIRUSPLASMIDE 37
2.8. ZELLKULTUR 41
2.8.1. ZELLEN 41
2.8.2. SPLIT 41
2.8.3. IMMORTALISIERUNG VON ZELLEN 42
2.8.4. EINFRIEREN VON ZELLEN 42
2.8.5. AUFLAUEN VON ZELLEN 42
2.8.6. TRANSFEKTION VON ZELLEN MIT TSCRL
CODIERENDEN PLASMIDEN 43
2.9.
REKOMBINANTE LENTIVIREN 43
2.9.1. GENERIERUNG REKOMBINANTER
LENTIVIREN 43
2.9.2. BESTIMMUNG
DES VIRUSTITERS/ELISA 45
4
HTTP://D-NB.INFO/1048076067
INHALTSVERZEICHNIS
2.9.3. TRANSDUKTION MIT VIRUS 45
2.10. MOLEKULARBIOLOGISCHE
ANALYSE-METHODEN 46
2.10.1. GENERIERUNG
VON ZELLKLONEN 46
2.10.2. RNA-ISOLATION 46
2.10.3. CDNA-SYNTHESE 47
2.10.4. REAL-TIME PCR 47
2.10.5. SYBR-GREEN PCR 49
2.10.6. TSCRL PROTEINISOLATION 50
2.10.7. QUANTIFIZIERUNG
VON PROTEINEN NACH BRADFORD 51
2.10.8. ISOLATION GENOMISCHER DNA 51
2.10.9. PRAEPARATIVER RESTRIKTIONSVERDAU GENOMISCHER
DNA 52
2.10.10. SOUTHERN BLOT 52
2.10.11. NORTHERN BLOT 55
2.10.12. WESTERN BLOT 57
2.10.13. COOMASSIE-STAINING VON SDS-GELEN 59
2.11. FUNKTIONELLE ANALYSE-METHODEN 60
2.11.1. LECTIN-STAINING VON ZELLSUSPENSIONEN 60
2.11.2. DURCHFLUSSZYTOMETRIE 60
2.11.3. MIKROSKOPIE 61
2.11.4. SULFORHODAMIN B ASSAY 61
2.11.5. PROPIDIUMIODID-ASSAY 62
2.11.6. CHROM-RELEASE 63
2.12. GENERIERUNG TRANSGENER
SCHWEINE 64
2.12.1. OHRPROBENGEWINNUNG UND ORGANENTNAHME 64
3. ERGEBNISSE 65
3.1. LENTIVIRALER KNOCKDOWN DER A-L,3-GALAKTOSYLTRANSFERASE 65
3.1.1. ANALYSE DER
A-L,3-GALAKTOSYLTRANSFERASE MRNA 65
3.1.2. SIRNA DESIGN 67
3.1.3. SCREENING
DER LENTIVIRALEN U6-SHRNA EXPRESSIONSKASSETTEN 69
3.1.4. OPTIMIERUNG
DER LENTIVIRALEN SHRNA KONSTRUKTE 70
3.1.4.1. AENDERUNG DER
SHRNA KASSETTE 70
3.1.4.2. VERWENDUNG VERSCHIEDENER PROMOTOREN ZUR SHRNA-TRANSKRIPTION 71
3.1.4.3. AENDERUNG DER ANZAHL
AN SHRNA KASSETTEN UND
LOKALISATION IM LENTIVIRALEN
VEKTOR...: 73
3.1.5. FUNKTIONELLE ANALYSEN
DER PSF MISCHPOPULATIONEN 75
3.1.5.1. ZELLWACHSTUM TRANSDUZIERTER PSF MISCHPOPULATIONEN 75
3.1.5.2. MIKROSKOPIE
TRANSDUZIERTER PSF
MISCHPOPULATIONEN 76
3.1.5.3. DURCHFLUSSZYTOMETRIE TRANSDUZIERTER
PSF MISCHPOPULATIONEN 77
3.1.5.4. SIRNA EXPRESSION IN TRANSDUZIERTEN PSF MISCHPOPULATIONEN 78
3.1.5.5. LYSE/CHROM-RELEASE ASSAY 79
3.1.6. GENERIERUNG VON ZELLKLONEN 81
3.1.6.1. BESTIMMUNG DER INTEGRANTENANZAHL IN DEN ZELLKLONEN 81
3.1.6.2. ANALYSE DER
AGT MRNA EXPRESSION IN DEN ZELLKONEN 82
3.1.6.3. LANGZEITANALYSE DES
AGT MRNA KNOCKDOWN IN DEN ZELLKLONEN 85
3.1.6.4. MIKROSKOPIE DER ZELLKLONE 85
3.1.6.5. ANALYSE
DER AGAL EPITOPE
DER ZELLKLONE 87
3.1.6.6. LYSE DER ZELLKLONE 89
3.1.6.7. SIRNA EXPRESSION IN DEN ZELLKLONEN 89
3.2. KOMBINATION VERSCHIEDENER EXPRESSIONSKASSETTEN IM LENTIVIRUS 90
3.2.1. GENERIERUNG MULTITRANSGENER LENTIVIRALER VEKTOREN 90
5
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.2. NACHWEIS
DER TRANSGENEXPRESSION PER
PCR 91
3.2.3. NACHWEIS
DES TSCRL PROTEINS 94
3.2.4. FUNKTIONELLE ANALYSEN DER
EINZEL- UND DOPPELTRANSGEN VEKTOREN 95
3.3. GENERIERUNG
TRANSGENER SCHWEINE 98
3.3.1. GENERIERUNG UND GEBURT VON SCHWEINEN 98
3.3.2. ANALYSE
DER INTEGRANTEN UND METHYLIERUNGEN 100
3.3.3. FUNKTIONELLE ANALYSE DES
TRANSGENEN SCHWEINES 9833 106
4. DISKUSSION 109
4.1. AUF
DER SUCHE NACH DER SHRNA MIT
DEM HOECHSTEN AGT MRNA SILENCING POTENTIAL
109
4.2. MIT U6-SHRNA LENTIVIRALEN VEKTOREN ZU ZELLKLONEN MIT STABILER SHRNA
EXPRESSION
112
4.3. MIT MULTITRANSGENEN LENTIVIRALEN VEKTOREN ZUR VERZOEGERTEN
ABSTOSSUNGSREAKTION 114
4.4. GENERIERUNG MULTITRANSGENER
SCHWEINE ALS
ENDZIEL 116
4.5. AUSBLICK IN DIE ZUKUNFT 119
5. ZUSAMMENFASSUNG 122
6. ANHANG 124
6.1. SEQUENZEN 124
6.1.1. AGT CDNA 124
6.1.2. TSCRL CDNA 125
6.1.3. ENDOGALC
CDNA 126
6.1.4. FE2A CDNA 127
6.2. TABELLEN 127
6.3. PLASMIDKARTEN 132
6.3.1. PTZU6+L 132
6.3.2. PBLUESCRIPT 133
6.3.3. MTD-PAAV-MCS 133
6.3.4. PRRL.SIN-18 134
6.3.5. PRSV REV 134
6.3.6. PMDLG/PRRE 135
6.3.7. PMD2.G 136
6.3.8. PSILENCER 1.0-U6 136
6.3.9. PRNA-U6.3/NEO 137
7. LITERATURVERZEICHNIS 138
8. LEBENSLAUF UND REFERENZEN 145
6
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