Aufbau und Validierung eines Enzyme-Capture-Assays zur Bestimmung von Plasmin:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2013
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| Beschreibung: | 123 S. graph. Darst. 21 cm |
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 10
1. EINLEITUNG 14
1.1 PHYSIOLOGISCHE GRUNDLAGEN DER BLUTGERINNUNG 14
111 EINLEITUNG 14
1.1.2 DIE PRIMAERE, ZELLULAERE HAEMOSTASE 14
1.1.3 DIE SEKUNDAERE, PLASMATISCHE HAEMOSTASE 17
1.1.4 DIE REGULATION DER HAEMOSTASE 22
1.2 DAS FIBRINOLYTISCHE SYSTEM 26
12 1 EINLEITUNG 26
1.2.2 PLASMIN ALS SCHLUESSELENZYM DER FIBRINOLYSE 26
1.2.3 DIE REGULATION DER FIBRINOLYSE 29
1.3 PATHOLOGIE, DIAGNOSTIK UND THERAPIE DES FIBRINOLYSESYSTEMS 31
1.3.1 STOERUNGEN DES FIBRINOLYSESYSTEMS 31
1.3.2 MARKER ZUR ANALYSE DES FIBRINOLYSESYSTEMS 33
1.3.3 MEDIKAMENTOESE EINGRIFFE IN DAS FIBRINOLYSESYSTEM 36
1.4 ZIELSETZUNG UND FRAGESTELLUNG 41
2. MATERIAL UND METHODIK 42
2.1 MATERIALIEN 42
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2.1.1 VERWENDETE CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 42
2.1.2 VERWENDETE PUFFERLOESUNGEN 44
2.1.3 VERWENDETE MATERIALIEN 45
2.1.4 VERWENDETE GERAETE 45
2.2 METHODIK 47
2.2.1 ALLGEMEINE VERSUCHSPRINZIPIEN 47
2.2.1.1 VERWENDUNG VERSCHIEDENER SUBSTRATE 47
2.2.1.2 VENWENDUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER ALS NACHWEISREAGENZ 49
2.2.1.3 ALLGEMEINER ABLAUF EINES ENZYME-CAPTURE-ASSAYS 52
2.2.1.4 VERWENDUNG REVERSIBLER PIASMININHIBITOREN ZUR VERMEIDUNG DER
BLOCKADE
DES AKTIVEN ZENTRUMS 54
2.2.2 SPEZIELLE VERSUCHSPRINZIPIEN 56
2.2.2.1 SPEZIELLER ABLAUF DES PLASMIN-ASSAYS 56
2.2.2.2 SPEZIELLER ABLAUF DES PLASMIN-ASSAYS MITTELS BIOTINYLIERTEM
APROTININ ....58
3. ERGEBNISSE 62
3.1 VORVERSUCHE IM GEREINIGTEN SYSTEM ZUR TESTETABLIERUNG 62
3.1.1 ERMITTLUNG DER OPTIMALEN VERSUCHSBEDINGUNGEN IM GEREINIGTEN SYSTEM
62
3.1.1.1 BESTIMMUNG DER AKTIVITAET VON PLASMIN IN VERSCHIEDENEN PUFFERN 62
3.1.1.2 BESTIMMUNG DER OPTIMALEN PLASMIN- UND SUBSTRATKONZENTRATIONEN 63
3.1.1.3 STABILISIERUNG DER PIASMINAKTIVITAET DURCH OPTIMIERUNG DES
PUFFERSYSTEM 65
3.1.1.4 DER OPTIMALE PUFFER UND DER PIASMINNACHWEIS IN DIESEM SYSTEM 69
3.1.1.5 DIE INTERAKTION VON PLASMINOGEN MIT DEM SUBSTRAT 71
3.1.2 ETABLIERUNG DES PLASMIN-ASSAYS IM GEREINIGTEN SYSTEM 72
3.1.2.1 DER EINFLUSS DER MONOKLONALEN ANTI-PLASMIN-ANTIKOERPER AUF DIE
AMIDOLYTISCHE AKTIVITAET VON PLASMIN 72
3.1.2.2 DIE BESTIMMUNG DER OPTIMALEN ANTIKOERPER-KONZENTRATION UND DER
EINFLUSS
DER TRANEXAMSAEURE AUF DIE BINDUNG DER ANTIKOERPER 73
3.1.2.3 DIE PLASMINNACHWEISGRENZE MITTELS ANTIKOERPERBESCHICHTETER
PLATTEN 75
3.1.2.4 DER EINFLUSS VON PLASMINOGEN AUF DAS TESTSYSTEM 76
3.2 VERWENDUNG VON PIASMININHIBITOREN ZUR VERMEIDUNG DER BLOCKADE DES
AKTIVEN ZENTRUMS 79
3.2.1 VERWENDUNG VERSCHIEDENER ACTIVE-SITE-LNHIBITOREN AUF PLASMIN 79
3.2.1.1 DER EINFLUSS DES POLYPEPTIDS APROTININ 79
3.2.1.2 DER EINFLUSS DER SERINPROTEASEN-INHIBITOREN BENZAMIDIN UND
P-AMINOBENZAMIDIN 81
3.2.2 UMGEHUNG DER INHIBITOREN MITTELS STABILIZED-PLASMA 84
3.3 ETABLIERUNG DES PLASMIN-ASSAYS MITTELS BIOTINYLIERTEM APROTININ 88
3.3.1 EINLEITUNG 88
3.3.2 VORBEREITUNG DES ENZYME-CAPTURE-ASSAYS 88
3.3.2.1 DER NACHWEIS DER BIOTINYLIERUNG DES APROTININS 88
3.3.3 DURCHFUEHRUNG DES ENZYME-CAPTURE-ASSAYS MITTELS BIOTINYLIERTEM
APROTININ 89
3.3.3.1 DER NACHWEIS VON PLASMIN IM GEREINIGTEN SYSTEM 89
3.3.3.2 DER NACHWEIS VON PLASMIN IM PLASMA 90
4. DISKUSSION 94
4.1 VORVERSUCHE IM GEREINIGTEN SYSTEM ZUR ETABLIERUNG DES PLASMIN-ASSAYS
94
4.1.1 DIE OPTIMIERUNG DES PUFFERSYSTEMS 94
4.1.2 DER EINFLUSS DER MONOKLONALEN ANTI-PLASMIN-ANTIKOERPER AUF DIE
AMIDOLYTISCHE
AKTIVITAET VON PLASMIN 95
4.1.3 DIE ROLLE DER TRANEXAMSAEURE 96
4.1.4 DER EINFLUSS DES ZYMOGENS PLASMINOGEN AUF DAS TESTSYSTEM 96
4.2 DER VERSUCH DER REVERSIBLEN INHIBITION VON PLASMIN 99
4.2.1 DIE PROBLEMATIK DES APROTININS 99
4.2.2 ANDERE VERFAHREN ZUR VERMEIDUNG DER BLOCKADE DES AKTIVEN ZENTRUMS
....100
4.3 BIOTINYLIERTES APROTININ ALS LOESUNGSANSATZ 102
4.3.1 DIE UMGEHUNG DER PROBLEMATIK DER REVERSIBLEN INHIBITION DURCH
BIOTINYLIERTES
APROTININ 102
4.3.2 DIE PROBLEMATIK DER NACHWEISGRENZEN DES ENZYME-CAPTURE-ASSAYS FUER
PLASMIN 102
4.4 AUSBLICK: DIE KLINISCHE RELEVANZ EINES PLASMIN-ASSAYS, DIE
PROBLEMATIK
DES GEZEIGTEN VERFAHRENS UND STRATEGIEN ZUR TESTOPTIMIERUNG 104
4.4.1
4.4.2
DIE KLINISCHE RELEVANZ EINES PLASMIN-ASSAYS 104
DIE PROBLEMATIK EINES ENZYME-CAPTURE-ASSAYS FUER PLASMIN UND MOEGLICHE
LOESUNGSANSAETZE ZUR ETABLIERUNG DES PIASMINNACHWEISES 106
5. ZUSAMMENFASSUNG 109
6. LITERATURVERZEICHNIS 111
7. DANKSAGUNG 123
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