Struktur-Funktions-Untersuchungen zur Hinge-Region in Glykoproteinhormon-Rezeptoren:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2013
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1. ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 5
2. EINLEITUNG 7
2.1 DIE G-PROTEIN-GEKOPPELTEN REZEPTOREN (GPCR) 7
2.2 DIE GLYKOPROTEINHORMON-REZEPTOREN (GPHR) 9
2.3 DIE TOPOLOGIE UND STRUKTUR DER GPHR 11
2.3.1 DIE LEUCINE-RICH REPEAT DOMAENE (LRRD) 13
2.3.2 DIE TRANSMEMBRANAERE SERPENTINDOMAENE (SD) 14
2.3.3 DIE HINGE-REGION 15
2.4 DIE SIGNALISIERUNGSEIGENSCHAFTEN DER GPHR 20
2.4.1 REZEPTORAKTIVIERUNG UND MODULATION 20
2.4.2 REZEPTOROLIGOMERISIERUNG UND INTERMOLEKULARE KOOPERATIVITAET 23
3. ZIELSETZUNG 26
4. MATERIAL & METHODEN 29
4.1 MATERIAL 29
4.1.1 REAGENZIEN 29
4.1.2 GERAETE .....30
4.1.3 KITS 31
4.1.4 ANTIKOERPER 31
4.1.5 SOFTWARE 32
4.2 OLIGONUKLEOTIDE 32
4.3 PUFFER UND LOESUNGEN 33
4.4 PLASMIDE 33
4.5 ORGANISMEN 35
4.6 ALLGEMEINE METHODEN 36
4.6.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 36
4.6.1.1 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 36
4.6.1.2 PRAEPARATION VON GENOMISCHER DNA AUS PICHIA PASTORIS (P.
PASTORIS) 36
4.6.1.3 DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 37
4.6.1.4 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 37
4.6.1.5 NUKLEINSAEUREAUFREINIGUNG 37
4.6.1.6 RESTRIKTIONSVERDAU UND LIGATION VON PLASMID-DNA 37
4.6.1.7 SEQUENZIERUNG 37
4.6.1.8 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 38
4.6.1.9 SPLICING BY OVERLAP EXTENTION PCR (SOE-PCR) 38
4.6.1.10 ZIELGERICHTETE MUTAGENESE 39
4.6.1.11 KOLONIE-PCR 40
4.6.2 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 40
4.6.2.1 HERSTELLUNG CHEMISCH KOMPETENTER ESCHERICHIA COLI (E. COLI) 40
I
HTTP://D-NB.INFO/104975137X
4.6.2.2 TRANSFORMATION KOMPETENTER E. COLI 41
4.6.2.3 HETEROLOGE PROTEINEXPRESSION IN E. COLI 41
4.6.2.4 HERSTELLUNG CHEMISCH KOMPETENTER P. PASTORIS 42
4.6.2.5 TRANSFORMATION KOMPETENTER P. PASTORIS 42
4.6.2.6 DETERMINIERUNG DES P. PASTORIS X-33 PHAENOTYPS MUT
+
/ MUT
S
43
4.6.2.7 SELEKTION VON P. PASTORIS X-33 MULTICOPY TRANSFORMANTEN 43
4.6.2.8 HETEROLOGE PROTEINEXPRESSION IN P. PASTORIS 43
4.6.3 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 44
4.6.3.1 KULTIVIERUNG VON HEK 293-ZEHEN 44
4.6.3.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON HEK 293-ZELLEN 44
4.6.3.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE (FACS) 45
4.6.4 PHARMAKOLOGISCHE METHODEN 45
4.6.4.1 CAMP-AKKUMULATIONS-ASSAY 45
4.6.5 MIKROSKOPISCHE METHODEN 47
4.6.5.1 KONFOKALE LASER-SCANNING -MIKROSKOPIE (LSM) 47
4.6.5.2 MEMBRANQUANTIFIZIERUNG 47
4.6.5.3 FLUORESCENCE CROSS-CORRELATION-SPEKTROSKOPIE (FCCS) 48
4.6.6 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 49
4.6.6.1 PROTEINPRAEPARATION FUER DIE STRUKTURELLEN VORUNTERSUCHUNGEN 49
4.6.6.2 PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG 50
4.6.6.3 SDS-PAGE 51
4.6.6.4 PROTEINNACHWEIS MITTELS IMMUNOBLOT (WESTERN BLOT) 52
4.7 EXPRESSION OFSOLUBLE PROTEINS BY RANDOM INCREMENTAL TRUNCATION
SYSTEM (ESPRIT-SYSTEM) 53
4.7.1 GENERIERUNG DER DNA-KONSTRUKTBIBLIOTHEK 53
4.7.2 TRANSFORMATION DER DNA-KONSTRUKTBIBLIOTHEK IN BL21 (DE3)-BAKTERIEN
55
4.7.3 UEBERFUEHRUNG DER BAKTERIENKOLONIEN AUF DIE NITROZELLULOSEMEMBRAN
UND REPLIKATION 55
4.7.4 DETEKTION DES MEMBRAN-SCANS 56
4.7.5 EXPRESSIONSTEST DER VALIDIERTEN BAKTERIENKLONE 57
5. ERGEBNISSE 58
5.1 HETEROLOGE EXPRESSION DER HINGE-REGION DES HUMANEN
THYREOTROPINREZEPTORS (TSHR) FUER
WEITERFUEHRENDE STRUKTURUNTERSUCHUNGEN 58
5.1.1 HERSTELLUNG GEEIGNETER HINGE-REGION-KONSTRUKTE DES TSHR FUER DIE
HETEROLOGE PROTEINEXPRESSION
IN E. COLI 58
5.1.2 EXPRESSIONSVEKTOREN FUER DIE ZYTOSOLISCHE PROTEINEXPRESSION IN E.
COLI 59
5.1.3 EXPRESSIONSVEKTOREN FUER DIE PERIPLASMATISCHE PROTEINEXPRESSION IN
E. COLI 59
5.1.4 EXPRESSIONSSTUDIEN DER HINGE-REGION-KONSTRUKTE DES TSHR IN E. COLI
60
5.1.5 HERSTELLUNG GEEIGNETER HINGE-REGION-KONSTRUKTE FUER DIE HETEROLOGE
PROTEINEXPRESSION IN P. PASTORIS 61
5.1.6 EXPRESSIONSSTUDIEN DER HINGE-REGION-KONSTRUKTE DES TSHR IN P.
PASTORIS 62
5.1.7 DAS ESPRIT-SYSTEM UND DESSEN ANWENDUNG AUF DIE HINGE-REGION DES
TSHR ZUR AUFFINDUNG STABILER
PROTEINKONSTRUKTE 62
5.1.7.1 GENERIERUNG DER TSHR HINGE-REGION-DNA-KONSTRUKTBIBLIOTHEK 63
5.1.7.2 PRIMAERSCREEN DER HINGE-REGION-DNA-KONSTRUKTBIBLIOTHEK 65
5.1.7.3 SEKUNDAERSCREEN UND VALIDIERUNG DER HINGE-REGION-KONSTRUKTE 67
5.1.7.4 HETEROLOGE PROTEINEXPRESSION UND PROTEINPRAEPARATION DES TSHR
HINGE-REGION-KONSTRUKTS
ESPRIT-4CED IN E. COLI 68
II
5.2 STRUKTUR-FUNKTIONS-UNTERSUCHUNGEN AN DER HINGE-REGION DES HUMANEN
LUTROPINREZEPTORS (LHR) 71
5.2.1 HERSTELLUNG VON LHR-MUTANTEN FUER ZELLBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 71
5.2.2 PARTIELL DEFIZIENTE LHR-MUTANTEN 71
5.2.3 UNTERSUCHUNG ZUR INTRA-UND INTERMOLEKULAREN REZEPTORAKTIVIERUNG AM
LHR 73
5.2.3.1 OBERFLAECHENEXPRESSION UND KOLOKALISATION DER PARTIELL
DEFIZIENTEN LHR-MUTANTEN 73
5.2.3.2 OLIGOMERISIERUNG DER LHR-MUTANTEN 74
5.2.3.3 INTERMOLEKULARE SIGNALISIERUNGSEIGENSCHAFTEN KOTRANSFIZIERTER
LHR-KONSTRUKTE 76
5.2.4 GENERIERUNG DER REZEPTOR-MUTANTEN ZUR STRUKTUR-FUNKTIONS-STUDIE AN
DER HINGE-REGION DES LHR ...80
5.2.4.1 OBERFLAECHENEXPRESSION UND KOLOKALISATION DER FUER DIE
STRUKTURUNTERSUCHUNG VERWENDETEN
LHR-MUTANTEN 81
5.2.4.2 SIGNALISIERUNGSEIGENSCHAFTEN DER LHR-POLYALANINBLOCK- UND
-PROLIN-KONSTRUKTE 82
6. DISKUSSION 84
6.1 DIE HINGE-REGION, EIN NICHT STRUKTURAUTONOMER
SIGNALISIERUNGSSENSITIVER BEREICH DER GPHR 84
6.1.1 EXPRESSIONSSTUDIEN ZUR ISOLIERUNG EINES TSHR
HINGE-REGION-FRAGMENTS FUER STRUKTURELLE
VORUNTERSUCHUNGEN 84
6.1.2 DIE KONSTRUKTAUSWAHL MITTELS ESPRIT-SYSTEMS ERMOEGLICHT EINE
VERBESSERTE PROTEINSTABILITAET 87
6.2 STRUKTUR-FUNKTIONS- STUDIEN AN DER HINGE-REGION DES LHR LIEFERN NEUE
ERKENNTNISSE ZUM
AKTIVIERUNGSMECHANISMUS DER GPHR 91
6.2.1 UNTERSUCHUNGEN DER INTRA-UND INTERMOLEKULAREN
SIGNALISIERUNGSEIGENSCHAFTEN DES LHR DECKEN
UNTERSCHIEDLICHE AKTIVIERUNGSPROFILE BEI LH- UND CG-STIMULATION AUF 91
6.2.2 STRUKTURELEMENTE IM SIGNALISIERUNGSSENSITIVEN EXONLO-BEREICH
FUNGIEREN ALS STRUKTURELLE PLATTFORM
FUER DIE CG-VERMITTELTE SIGNALAMPLIFIKATION 100
7. LITERATUR 108
8. ANHNG 120
8.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 120
8.2 ABKUERZUNG DER AMINOSAEUREN 123
8.3 THEMENRELEVANTE PUBLIKATIONEN, VORTRAEGE, POSTER UND ABSTRACTS 124
8.3.1 THEMENRELEVANTE PUBLIKATIONEN 124
8.3.2 VORTRAEGE 124
8.3.3 POSTER UND ABSTRACTS 124
9. ERKLAERUNG 125
III
|
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