Stöchiometrie und Interaktionen der Untereinheiten von ECF-Transportern:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German English |
| Veröffentlicht: |
Berlin
2013
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| Beschreibung: | 137 S. Ill., graph. Darst. |
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Datensatz im Suchindex
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG 1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 8
VORWORT 10
1 EINLEITUNG 11
1.1 TRANSPORT UEBER MEMBRANEN 11
1.2 ABC-TRANSPORTER 11
1.2.1 KLASSIFIZIERUNG UND BEDEUTUNG DER ABC-TRANSPORTER 11
1.2.2 KANONISCHE ABC-IMPORTER 14
1.3 ECF-TRANSPORTER 19
1.3.1 KLASSIFIZIERUNG DER ECF-TRANSPORTER 20
1.3.2 DIE SUBSTRATSPEZIFISCHEN TRANSMEMBRANKOMPONENTEN
(S-EINHEITEN) 21
1.3.3 DAS ENERGETISIERUNGSMODUL (A- UND T-EINHEITEN) 24
1.4 ZIELSETZUNGEN DER ARBEIT 25
2 ERGEBNISSE 27
2.1 INTERAKTIONEN ZWISCHEN DEN UNTEREINHEITEN DES BIOTIN-TRANSPORTERS IN
DER LEBENDEN
ZELLE 27
2.1.1 KONSTRUKTION VON MCER- UND MYFP-MARKIERTEN
BIOTIN-TRANSPORTER-KOMPONENTEN27
2.1.2 LOKALISATION UND STABILITAET DER FLUOROPHORMARKIERTEN PROTEINE IN
REKOMBINANTEN E.
COLI BL21-GOLD-ZELLEN 28
2.1.3 FUNKTIONALITAET DER FLUOROPHORMARKIERTEN PROTEINE 29
2.1.4 OLIGOMERZUSTAND UND INTERAKTIONEN VON BIOM 31
2.1.5 OLIGOMERZUSTAND VON BIOY 34
2.2 DIE KOPPELNDE FUNKTION DER T-KOMPONENTE BION 35
2.2.1 AUSWIRKUNGEN DER SUBSTITUTION DER KONSERVIERTEN ARGININE AUF DIE
STABILITAET VON
BIOMNY 36
2.2.2 WEITERE EINZELSUBSTITUTIONEN DER KONSERVIERTEN ARGININE IN BION 38
2.3 IDENTIFIZIERUNG DER INTERAKTIONSSTELLEN ZWISCHEN BIOM UND BION MIT
HILFE VON
ORTSSPEZIFISCHER QUERVERNETZUNG 3 8
2.3.1 VORAUSSETZUNGEN ZUR HERSTELLUNG VON MONO- UND
DOPPEL-CYSTEIN-MUTANTEN 39
2.3.2 BIOTIN-TRANSPORTER MIT EINZELNEN CYSTEINRESTEN IN BIOM 43
2.3.3 BIOTIN-TRANSPORTER MIT EINZELNEN CYSTEINRESTEN IN BION 46
2.3.4 ORTSSPEZIFISCHES QUERVERNETZEN VON BIOM MIT BION 49
2.4 INTERAKTION VON UNTEREINHEITEN IM KOBALT-TRANSPORTER CBIMNQO 54
2.4.1 ANALYSE DER KOMPLEXSTABILITAET VON CBIMNQO UND CBIMN 55
2.4.2 TRANSPORTER-VARIANTEN MIT FUSIONIERTER CBI(MN)-DOMAENE 57
3 DISKUSSION 58
3.1 EIN CHARAKTERISTIKUM VON ECF-TRANSPORTERN: DIE S-KOMPONENTE 58
3.1.1 TRANSPORT DURCH SOLITAERE S-EINHEITEN 59
3.1.2 OLIGOMERZUSTAND VON S-EINHEITEN 61
3.2 INTERAKTIONEN DER T-KOMPONENTE MIT DEN ATPASEN IM
ECF-HOLOTRANSPORTER 66
3.3 EIN HYPOTHETISCHER TRANSPORTMECHANISMUS 79
4
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INHALTSVERZEICHNIS
4 MATERIAL & METHODEN 83
4.1 ORGANISMEN UND PLASMIDE 83
4.2 KONSTRUKTIONSBESCHREIBUNG DER VERWENDETEN PLASMIDE 84
4.2.1 KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSPLASMIDEN MIT VERAENDERTEN BIOMNY-GENEN
AUS
RHODOBACTER CAPSULATUS 84
4.2.2 KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSPLASMIDEN MIT VERAENDERTEN
CBIMNQO-GENEN AUS
RHODOBACTER CAPSULATUS 91
4.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 93
4.3.1 DNA-PRAEPARATION 93
4.3.2 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA IN AGAROSEGELEN 94
4.3.3 DNA-MODIFIKATIONEN 94
4.3.4 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 96
4.3.5 REINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN 99
4.3.6 CHEMISCHE TRANSFORMATION VON E. COLI 99
4.3.7 SEQUENZIERUNG 100
4.3.8 AUSWERTUNG DER SEQUENZDATEN 100
4.4 KULTIVIERUNG DER BAKTERIEN 100
4.4.1 NAEHRMEDIEN 100
4.4.2 ANTIBIOTIKA 101
4.4.3 ZELLANZUCHT 101
4.4.4 ZELLDICHTEMESSUNG 101
4.4.5 LAGERUNG VON BAKTERIENKULTUREN 102
4.4.6 ZELLERNTE 102
4.5 ZELLAUFSCHLUSS UND HERSTELLUNG VON EXTRAKTEN 102
4.5.1 ZELLAUFSCHLUSS 102
4.5.2 HERSTELLUNG VON ISOLIERTEN UND HOMOGENISIERTEN MEMBRANVESIKELN 103
4.5.3 HERSTELLUNG VON MEMBRANEXTRAKTEN: SOLUBILISIERUNG VON
MEMBRANPROTEINEN MIT
DDM 103
4.6 METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 104
4.6.1 BRADFORD-SCHNELLTEST 104
4.6.2 PIERCE BICINCHONINSAEURE (BCA)-PROTEINBESTIMMUNG 104
4.6.3 LOWRY PROTEINBESTIMMUNG 104
4.7 SDS-POLYACRYLAMID-GELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 105
4.8 WESTERN BLOT 106
4.8.1 SEMI-DRY-BLOT 106
4.8.2 BLOCKIEREN VON GEBLOTTETEN NITROCELLULOSEMEMBRANEN 107
4.8.3 IMMUNDETEKTION 107
4.9 REINIGUNG VON PROTEINEN MITTELS AFFINITAETSCHROMATOGRAFIE 108
4.9.1 REINIGUNG UEBER NICKEL-NTA SUPERFLOW 109
4.9.2 REINIGUNG VON PROTEINEN UEBER STREP-TACTIN SUPERFLOW 110
4.10 GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAFIE 111
4.10.1 GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAFIE (GELFILTRATION) AN DER AEKTA 111
4.10.2 UMPUFFERN VON PROTEINLOESUNGEN 112
4.11 KONZENTRIEREN VON PROTEINLOESUNGEN 112
4.12 CHEMISCHES QUERVERNETZEN ZWEIER CYSTEINE, VERMITTELT DURCH
KUPFERPHENANTHROLIN.... 113
5
INHALTSVERZEICHNIS
4.12.1 CHEMISCHES QUERVERNETZEN IN ISOLIERTEN MEMBRANEN 113
4.12.2 CHEMISCHES QUERVERNETZUNG VON ISOLIERTEN BIOMNY-PROTEIN-KOMPLEXEN
114
4.13 AUFNAHMEMESSUNGEN MIT RADIOAKTIVEN SUBSTRATEN 115
4.13.1 QUANTIFIZIERUNG DER BIOTIN-AUFNAHME REKOMBINANTER E. COLI-ZELLEN
115
4.13.2 QUANTIFIZIERUNG DER CO
2+
-AUFNAHME REKOMBINANTER E. COLI-ZELLEN 115
4.14 ATPASE-AKTIVITAETS-TEST 116
4.14.1 ENZYMREAKTION 117
4.14.2 FARBREAKTION 117
4.15 FLUORESZENZMIKROSKOPIE AM KONFOKALEN LASER-SCAN-MIKROSKOP 118
4.15.1 PROBENVORBEREITUNG 118
4.15.2 MEMBRANMARKIERUNG, PRAEPARATION UND MIKROSKOPIE 118
4.16 MESSUNG DER FLUORESZENZLEBENSDAUER MITTELS LEBENSZEIT-SPEKTROMETER
119
4.16.1 PROBENVORBEREITUNG 119
4.16.2 MESSUNGEN AM LEBENSZEIT-SPEKTROMETER 119
4.16.3 AUSWERTUNG 120
4.17 CHEMIKALIEN 121
4.18 EDV UND WEBBASIERTE DIENSTE 121
5 LITERATURVERZEICHNIS 123
DANKSAGUNG 135
LEBENSLAUF 136
EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 137
6 ANHANG 138
6
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