Nanopartikuläre Trägersysteme für Tetrapyrrole:
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2013
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|---|---|
| adam_text | 1. EINFUEHRUNG 1
1.1. MOTIVATION 1
1.2. ZIEL DER ARBEIT 2
1.3. STRUKTURIERUNG DER ARBEIT 2
1.4. NANOPARTIKULAERE TRAEGERSYSTEME 3
1.4.1. ALLGEMEINE PRINZIPIEN 4
1.4.1.1. PASSIVES TARGETING 5
1.4.1.2. AKTIVES TARGETING 6
1.4.2. POLYMILCH-CO-GLYKOLSAEURE 7
1.4.3. METHODEN ZUR HERSTELLUNG VON PLGA-NANOPARTIKELN 8
1.4.3.1. EMULSIONSEVAPORATIONSMETHODE 9
1.4.3.2. EMULSIONSDIFFUSIONSMETHODE 9
1.4.3.3. NANOPRAEZIPITATIONSMETHODE 10
1.4.3.4. AUSSALZMETHODE 10
1.4.4. PLGA-NANOPARTIKEL 11
1.4.4.1. PERORALE APPLIKATION VON PLGA-NANOPARTIKELN 12
1.4.4.2. FELDFLUSSFRAKTIONIERUNG 13
1.5. PHOTODYNAMISCHE THERAPIE 15
1.5.1. PHOTOSENSIBILISATOREN 16
1.5.2. ZUGELASSENE FERTIGARZNEIMITTEL FUER EINE PHOTODYNAMISCHE THERAPIE
19
1.6. IN VITRO UNTERSUCHUNGEN 22
1.6.1. ZELLULAERE AUFNAHMEMECHANISMEN 22
1.6.2. ZYTOTOXIZITAETSUNTERSUCHUNGEN 24
1.6.3. DARMBARRIERE 26
1.6.3.1. CACO-2-MODELL 27
2. MATERIALIEN UND METHODEN 31
2.1. CHEMIKALIEN 31
2.2. GERAETE UND SOFTWARE 35
2.3. VEBRAUCHSMATERIAL 39
2.4. PUFFER UND LOESUNGEN 41
2.5. ZELLKULTURMEDIEN 42
2.6. PHOTOSENSIBILISATOREN 43
2.7. HERSTELLUNG VON NANOPARTIKELN 44
2.7.1. HERSTELLUNG VON NANOPARTIKELN AUF BASIS VON PLGA 44
2.7.2. ENTWICKLUNG EINES STANDARDPROTOKOLLS FUER DIE HERSTELLUNG PLGA-
BASIERTER NANOPARTIKEL IN REDUZIERTEM MASSSTAB 44
2.7.3. HERSTELLUNG VON NANOPARTIKELN AUF BASIS VON PLGA-PEG 45
2.7.4. HERSTELLUNG PHOTOSENSIBILISATOR-BELADENER PLGA-NANOPARTIKEL 45
2.7.5. HERSTELLUNG LUMOGEN-BELADENER NANOPARTIKEL FUER DIE
FLUORESZENZMIKROSKOPIE 46
2.7.6. HERSTELLUNG PHOTOSENSIBILISATOR-BELADENER NANOPARTIKEL AUF BASIS
VON PLA 46
2.7.7. AUFREINIGUNG DER PARTIKELSUSPENSIONEN 47
2.8. TROCKNUNGSVERFAHREN 48
2.8.1. GEFRIERTROCKNUNG 48
2.8.1.1. BESTIMMUNG DES WASSERGEHALTS MITTELS KARL-FISCHER-TITRATION 48
2.8.2. SPRUEHTROCKNUNG 49
2.9. PHYSIKOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER PARTIKELSYSTEME 50
2.9.1. PARTIKELGROESSENBESTIMMUNG UND ZETAPOTENZIALMESSUNG 50
2.9.2. RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE 50
2.9.3. GRAVIMETRISCHE BESTIMMUNG DES NANOPARTIKELGEHALTS 50
2.9.4. QUANTITATIVE BESTIMMUNG DES VERBLEIBENDEN POLYVINYLALKOHOLS IM
PARTIKELSYS
TEM 51
2.9.4.1. KOMPLEXIERUNGSREAKTION MIT IOD 51
2.9.4.2. NAHINFRAROTSPEKTROSKOPIE 51
2.9.5. QUANTIFIZIERUNG DER PHOTOSENSIBILISATOREN MITTELS HPLC 52
2.9.5.1. MTHPP 52
2.9.5.2. BLC6075 52
I
HTTP://D-NB.INFO/1043873163
INHALTSVERZEICHNIS
2.9.6. UNTERSUCHUNGEN ZU DER STABILITAET DER WAESSRIGEN
NANOPARTIKELSUSPENSION 52
2.9.7. UNTERSUCHUNGEN ZUR BELADUNGSSTABILITAET DER NANOPARTIKEL 53
2.10. PERORALE DARREICHUNGSFORM 54
2.10.1. ENTWICKLUNG EINER NANOPARTIKELHALTIGEN TABLETTENREZEPTUR 54
2.10.1.1. HERSTELLUNG VON PLGA-NANOPARTIKELLYOPHILISATEN FUER DIE
TABLETTIERUNG 54
2.10.2. HERSTELLUNG DER TABLETTEN 55
2.10.3. FREISETZUNGSTEST 55
2.10.3.1. NANOPARTIKELQUANTIFIZIERUNG MITTELS ASYMMETRISCHER
FLUSS-FELDFLUSS-
FRAKTIONIERUNG 56
2.10.3.2. TABLETTEN MIT PLGA-NANOPARTIKELN 56
2.10.3.3. TABLETTEN MIT MTHPP-PLGA-NANOPARTIKELN 56
2.10.4. GLEICHFOERMIGKEIT DER MASSE 57
2.10.5. GLEICHFOERMIGKEIT DES GEHALTS 57
2.10.5.1. TABLETTEN MIT PLGA-NANOPARTIKELN 57
2.10.5.2. TABLETTEN MIT MTHPP-PLGA-NANOPARTIKEL 57
2.10.6. BRUCHFESTIGKEITSTEST 58
2.10.7. ZERFALLSTEST 58
2.11. IN VITRO ZELLKULTURUNTERSUCHUNGEN 59
2.11.1. STERILE ARBEITSTECHNIK 59
2.11.2. ZELLLINIEN - 59
2.11.2.1. CACO-2 59
2.11.2.2. TFK-1 59
2.11.3. LAGERUNG UND AUFTAUEN VON ZELLEN 60
2.11.4. PASSAGIEREN DER ZELLEN 60
2.11.5. ZELLPROLIFERATION 60
2.11.6. ZELLULAERE AUFNAHME VON PHOTOSENSIBILISATOREN 61
2.11.6.1. FLUORESZENZMESSUNGEN NACH ZELLLYSE 61
2.11.6.2. NACHWEIS DER ZELLULAEREN AUFNAHME MITTELS FLUORESZENZ- U.
KONFOKALMIKROSKOPIE... 62
2.11.7. ZYTOTOXIZITAETSUNTERSUCHUNGEN 62
2.11.7.1. AKTIVIERUNG DER PHOTOSENSIBILISATOREN 62
2.11.7.2. BESTIMMUNG DER ZELLVIABILITAET (WST-1 ASSAY) 63
2.11.7.3. BESTIMMUNG DER ZELLMEMBRANINTEGRITAET (LDH-ASSAY) 64
2.11.7.4. BESTIMMUNG DER APOPTOSEINDUKTION (CASPASE-3-AKTIVIERUNG) 65
2.11.7.5. PROTEINBESTIMMUNG MITTELS BICINCHONINSAEURE-ASSAY 65
2.11.8. UNTERSUCHUNGEN ZUM INTESTINALEN TRANSPORT IN VITRO 66
2.11.8.1. BESTIMMUNG DES TEER MITTELS GLEICHSTROMMESSUNG 67
2.11.8.2. BESTIMMUNG DES TEER DURCH IMPEDANZSPEKTROSKOPIE 67
2.11.9. STATISTISCHE VERFAHREN 67
3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 69
3.1. HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER NANOPARTIKEL 71
3.1.1. HERSTELLUNG VON PLGA-NANOPARTIKELN 71
3.1.2. ENTWICKLUNG EINES STANDARDPROTOKOLLS ZUR HERSTELLUNG VON
PLGA-NANO
PARTIKELN IN REDUZIERTEM MASSSTAB 72
3.1.2.1. PVA-KONZENTRATION 73
3.1.2.2. DISPERGIERGESCHWINDIGKEIT 74
3.1.2.3. DISPERGIERZEIT 74
3.1.2.4. ZUSAMMENFASSUNG 75
3.1.3. HERSTELLUNG VON PLGA-PEG-NANOPARTIKELN 76
3.1.4. HERSTELLUNG VON PS-PLGA-NANOPARTIKELN 77
3.1.5. HERSTELLUNG VON PS-PLGA-PEG-NANOPARTIKELN 79
3.1.6. HERSTELLUNG VON PS-PLA-NANOPARTIKELN 81
3.1.7. BESTIMMUNG DER EINSCHLUSSEFFIZIENZ UND DES DRUG LOADS DER
HERGESTELLTEN
PS-NANOPARTIKEL 82
3.1.8. VERWENDUNG ALTERNATIVER STABILISATOREN 83
3.1.9. QUANTITATIVE BESTIMMUNG DES VERBLEIBENDEN POLYVINYLALKOHOLS 84
3.1.9.1. PVA-BESTIMMUNG MITTELS KOMPLEXIERUNGSREAKTION MIT IOD 85
3.1.9.2. PVA-BESTIMMUNG MITTELS NAHINFRAROTSPEKTROSKOPIE 86
3.1.10. ZUSAMMENFASSUNG DER HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER
NANOPARTIKEL... 90
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.TROCKNUNGSVERFAHRE N 91
3.2.2. GEFRIERTROCKNUNG 91
3.2.1.1. KARL-FISCHER-TITRATION 92
3.2.2. SPRUEHTROCKNUNG 92
3.3. UNTERSUCHUNGEN ZU DER STABILITAET DER NANOPARTIKELSYSTEME 95
3.3.1. UNTERSUCHUNGEN ZU DER LAGERSTABILITAET DER WAESSRIGEN
PARTIKELSUSPENSION 95
3.3.2. UNTERSUCHUNGEN ZUR BELADUNGSSTABILITAET DER PARTIKELSYSTEME 101
3.3.3. UNTERSUCHUNGEN ZU DER STABILITAET DER PARTIKELSYSTEME IM
ZELLKULTURMEDIUM.... 103
3.4. PERORALE DARREICHUNGSFORM 108
3.4.1. ENTWICKLUNG DER NANOPARTIKELHALTIGEN TABLETTENREZEPTUR 108
3.4.2. QUALITAETSKONTROLLE DER NANOPARTIKEL UND DER HERGESTELLTEN
TABLETTEN 111
3.4.2.1. HERSTELLUNG VON PLGA-NANOPARTIKELN FUER DIE TABLETTIERUNG 111
3.4.2.2. TABLETTIERUNG 112
3.4.2.3. GLEICHFOERMIGKEIT DER MASSE 112
3.5.2.4. GLEICHFOERMIGKEIT DES GEHALTS 113
3.4.2.5. BRUCHFESTIGKEIT 113
3.4.2.6. ZERFALLSTEST 113
3.4.2.7. FREISETZUNG 114
3.4.2.7.1. ETABLIERUNG UND VALIDIERUNG EINER AF4-METHODE 115
3.4.2.7.2. FREISETZUNG DER PLGA-NANOPARTIKELTABLETTEN 119
3.4.2.7.3. FREISETZUNG DER MTHPP-PLGA-NANOPARTIKELTABLETTEN 120
3.4.2.8. RASTERELEKTRONENMIKROSKOPISCHE AUFNAHMEN 121
3.4.3. ZUSAMMENFASSUNG 124
3.5. IN VITRO ZELLKULTURUNTERSUCHUNGEN 125
3.5.1. CHARAKTERISIERUNG DER ZELLLINIEN 125
3.5.1.1. CACO-2-ZELLEN 125
3.5.1.2. TFK-L-ZELLEN 127
3.5.2. ZELLULAERE AUFNAHME VON PHOTOSENSIBILISATOREN 128
3.5.2.1. FLUORESZENZMESSUNGEN NACH ZELLLYSE 128
3.5.2.2. NACHWEIS DER ZELLULAEREN AUFNAHME DER PHOTOSENSIBILISATOREN
MITTELS
FLUORESZENZ- UND KONFOKALMIKROSKOPIE 135
3.5.2.3. UNTERSUCHUNGEN ZUM AUFNAHMEMECHANISMUS DER NANOPARTIKEL 139
3.5.3. ZYTOTOXIZITAETSUNTERSUCHUNGEN 141
3.5.3.1. BESTIMMUNG DER ZELLVIABILITAET (WST-L-ASSAY) 142
3.5.3.2. BESTIMMUNG VON EC
50
-WERTEN 148
3.5.3.3. BESTIMMUNG DER ZELLMEMBRANINTEGRITAET (LDH-ASSAY) 149
3.5.3.4. BESTIMMUNG DER APOPTOSEINDUKTION (CASPASE-3-AKTIVIERUNG) 153
3.5.3.5. ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHUNGEN ZUR ZYTOTOXIZITAET 156
3.5.4. UNTERSUCHUNGEN AM CACO-2-MODELL 158
3.5.4.1. AUSWAHL DES FILTERINSERTS 158
3.5.4.2. BESTIMMUNG DES TEER MITTELS GLEICHSTROMMESSUNG 160
3.5.4.3. BESTIMMUNG DES TEER MITTELS IMPEDANZSPEKTROSKOPIE 160
3.5.4.4. UNTERSUCHUNGEN DES TRANSPORTS DER NANOPARTIKEL UEBER DIE
CACO-2-BARRIERE 161
3.5.4.5. RASTERELEKTRONENMIKROSKOPISCHE AUFNAHMEN 165
4. ZUSAMMENFASSUNG 169
4.1. AUSBLICK 174
5. ANHANG 177
5.1. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 178
5.2. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 180
5.3. TABELLENVERZEICHNIS 182
5.4. LITERATURVERZEICHNIS 183
5.5. LEBENSLAUF 193
5.6. VEROEFFENTLICHUNGEN UND TAGUNGSBEITRAEGE 194
5.6.1. VEROEFFENTLICHUNGEN 194
5.6.2. TAGUNGSBEITRAEGE 194
III
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