Entwicklung von neuen Verfahren zur Ultra-Hochdurchsatz-Durchmusterung von kombinatorischen Oxidase- und Antikörperbibliotheken:
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2013
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG UND
ZIELSETZUNG
7
1.1 PROTEIN DESIGN
10
1.1.1 PROTEIN DESIGN VON ENZYMEN 12
1.2 METHODEN ZUR PRAESENTATION
UND DURCHMUSTERUNG VON KOMBINATORISCHEN
BIBLIOTHEKEN 14
1.2.1 PHAGE DISPLAY 15
1.2.2 OBERFLAECHENPRAESENTATION VON PROTEINEN AUFE. COLI ZELLEN 17
1.2.3 OBERFLAECHENPRAESENTATION VON PROTEINEN AUF SACCHAROMYCES CEREVISIAE
19
1.3 OXIDOREDUKTASEN 21
1.3.1 GLUKOSE OXIDASE 22
1.3.2 GALAKTOSE OXIDASE 23
1.4 VERFAHREN ZUR DURCHMUSTERUNG VON OBERFLAECHENPRAESENTIERTEN
ENZYMBIBLIOTHEKEN IM
HOCHDURCHSATZ ..
26
1.5 GENERIERUNG VON SPEZIFISCHEN BINDEMOLEKUELEN 28
1.5.1 IMMUNGLOBULIN BASIERTE BINDEMOLEKUELE 29
1.6 ZIELSETZUNG 31
2 MATERIALIEN 32
2.1 BAKTERIENSTAEMME 32
2.2 HEFESTAEMME 33
2.3 PLASMIDE 34
2.3.1 PASKIN
TL 1 OGOASEML 34
2.3.2 PESTL
00G
OASEML 35
2.3.3 PAK2(X)GOASEML 36
2.3.4 PASK75GOASEML 37
2.3.5 PET16BTARGET 38
2.3.6 PCTGOX 39
2.3.7 DNA-LAENGENSTANDARDS UND PROTEIN-MOLEKULARGEWICHTSMARKER 40
2.3.8 MOLEKULARGEWICHTSMARKERFUER PROTEINE 40
2.4 OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDE 41
2.5 ENZYME UND
PROTEINE 44
2.6 CHEMIKALIEN 44
2.7 SONSTIGE
MATERIAUEN UND GERAETE 45
2.7.1 NAEHRMEDIEN ZUR ANZUCHT VON E. COLI 46
2.7.2 NAEHRMEDIEN ZUR ANZUCHT VON SACCHAROMYCES CEREVISIAE 46
2.8 LOESUNGEN UND PUFFER 47
INHALTSVERZEICHNIS
I
3 METHODEN 52
3.1 MIKROBIOLOGISCHE
ARBEITSMETHODEN 52
3.1.1 ARBEITEN MIT BAKTERIEN 52
3.1.2 ARBEITEN MIT PHAGEN 53
3.1.3 ARBEITEN MIT HEFEN 54
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE
ARBEITSMETHODEN 56
3.2.1 STERILISATION VON VERWENDETEN GERAETEN 56
3.2.2 FAELLUNG VON DNA MIT AMMONIUMACETAT UND ETHANOL 57
3.2.3 PHENOL/CHLOROFORM EXTRAKTION VON DNA AUS WAESSRIGEN LOESUNGEN 57
3.2.4 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 58
3.2.5 EXTRAKTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN MIT HILFE DES WIZARD SV GEL
AND PCR
CLEAN-UP-SYSTEM-KITS
(PROMEGA) 59
3.2.6 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS
ESCHERICHIA COLI. 59
3.2.7 DICHTEZENTRIFUGATION MITTELS SUCROSE GRADIENT 60
3.2.8 BESTIMMUNG DER KONZENTRATION VON DNA IN WAESSRIGEN LOESUNGEN 61
3.2.9 BESTIMMUNG DES PHAGENTITERS 61
3.3 ENZYMATISCHE
MANIPULATION VON DNA 62
3.3.1 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 62
3.3.2 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 62
3.3.3 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 63
3.3.4 KOLONIE PCR-REAKTION 64
3.3.5 SPLICING BY OVERLAP EXTENSION PCR (SOE-PCR) 64
3
.4 P
ROTEINCHEMISCHE
A
RBEITSMETHODEN 66
3.4.1 POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 66
3.4.2 NACHWEIS VON PROTEINEN AUF NITROZELLULOSE-MEMBRANEN UEBER DIE
BINDUNG EINES SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERS (WESTERN BLOT) 68
3.4.3 AUFSCHLUSS VON BAKTERIENZELLEN MITTELS ULTRASCHALL 69
3.4.4 AUFSCHLUSS VON BAKTERIENZELLEN MITTELS FRENCH PRESS 70
3.4.5 IMMOBILIZED METAL CHELATE AFFINITY CHROMATOGRAPHY (IMAC) 70
3.4.6 GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE (GFC) 71
3.4.7 DIALYSE VON PROTEINEN 71
3.4.8 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN 71
3.5 OXIDATION VON PROTEINEN
MITTELS NATRIUMPERIODAT 72
3.6 ENZYMATISCHE
AKTIVITAETSTESTS BZW. MARKIERUNG VON MIKROBIOLOGISCHEN
ENTITAETEN MITTELS
BIOTINTYRAMID.
72
3.6.1 NACHWEIS VON
OXIDASE AKTIVITAET MITTELS ABTS ODER AMPLEX
RED 72
3.6.2 NACHWEIS DER OXIDASE AKTIVITAET MITTELS SOLID PHASE ASSAY 73
3.6.3 BIOTINTYRAMID MARKIERUNG VON E. COLI ZELLEN (PLLL
DISPLAY) MITTELS OXIDASE AKTIVITAET 75
INHALTSVERZEICHNIS
II
3.6.4 BIOTINTYRAMID MARKIERUNG VON MIKROBIELLEN ENTITAETEN MITTELS
OXIDASE AKTIVITAET 75
3.6.5 PHAGEN-ELISA 77
3.7 ZELLBIOLOGISCHE
ARBEITSMETHODEN 78
3.7.1 IMMUNFLUORESZENZ-MARKIERUNG VON ZELLEN 78
3.7.2 DURCHFLUSSZYTOMETRIE VON ESCHERICHIA COLI-ZELLEN 79
3.7.3 MAGNETISCHE SORTIERUNG VON PRODUZIERTEN PHAGEN (MACS) 79
3.8 CHEMISCHE ARBEITSMETHODEN 80
3.8.1 BIOTINTYRAMID SYNTHESE 80
3.9 PYROSEQUENZIERUNG VON KOMBINATORISCHEN
BIBLIOTHEKEN 81
3.10 BIOLAYERINTERFEROMETIE
MESSUNGEN ZUR
BESTIMMUNG VON BINDUNGSEIGENSCHAFTEN 83
4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 85
4.1 ETABLIERUNG EINES
HOCHSATZ - DURCHMUSTERUNGSVERFAHRENS FUER OXIDASEN AUF
DER OBERFLAECHE VON
E.
COLI
ZELLEN 85
4.1.1 PRAESENTATION VON OXIDASEN AUFE. COLI ZELLEN 85
4.1.2 PRAESENTATION VON OXIDASEN AUF E. COLI ZELLEN MITTELS PLLL DISPLAY
TECHNOLOGIE 87
4.1.3 DISKUSSION 94
4.2
DURCHMUSTERUNG VON OXIDASE BIBLIOTHEKEN MITTELS
PHAGE DISPLAY TECHNOLOGY
97
4.2.1 PRAESENTATION VON OXIDASEN AUF PHAGEN 98
4.2.2 VALIDIERUNG DES VERFAHRENS ZUR ISOLIERUNG VON ENZYMATISCH AKTIVEN
OXIDASEN MITTELS PHAGE DISPLAY
99
4.2.3 ERSTELLUNG EINER GALAKTOSE OXIDASE VARIANTENBIBLIOTHEK MITTELS
ERROR PRONE PCR 101
4.2.4 CHARAKTERISIERUNG DER GENERIERTEN VARIANTENBIBLIOTHEK MITTELS 454
SEQUENZER 103
4.2.5 DISKUSSION 106
4.3 ENTWICKLUNG EINES
HOCHDURCHSATZ-DURCHMUSTERUNGSVERFAHRENS FUER ANTIKOERPERBIBLIOTHEKEN
DURCH
ENZYMVERMITTELTE
REPORTERDEPOSITION 111
4.3.1 GENERIERUNG DES OXIDASE-ZIELPROTEIN KONJUGATES 113
4.3.2
NACHWEIS DER FUNKTIONALITAET DES VERWENDETEN ANTI LIPH
V
H
HS
SOWIE DER ENZYMVERMITTELTEN
REPORTERDEPOSITION 117
4.3.3 DURCHFUEHRUNG VON MISCHUNGSEXPERIMENTEN 119
4.3.4 ISOLATION VON SPEZIFISCHEN BINDERN VIA
3
CARD 123
4.3.5
WEITERENTWICKLUNG DES
3
CARD
VERFAHRENS
UND ISOLATION VON WEITEREN TARGET BINDENDEN
V
H
HS...
127
4.3.6 DISKUSSION 128
4.4 ENTWICKLUNG EINES VERFAHRENS ZUR DURCHMUSTERUNG VON OXIDASE
BIBLIOTHEKEN UNTER VERWENDUNG DER
YEAST
D/SPM/TECHNOLOGIE 132
4.4.
1 PRAESENTATION VON OXIDASEN AUF HEFEN 133
4.4.2 ERSTELLUNG UND VALIDIERUNG VON OXIDASE
VARIANTEN BIBLIOTHEKEN FUER DIE YEAST DISPLAY TECHNOLOGIE...
137
INHALTSVERZEICHNIS III
4.4.3 OPTIMIERUNG UND ANWENDUNG DES VERFAHRENS ZUR DURCHMUSTERUNG VON
OXIDASE
VARIANTENBIBLIOTHEKEN MITTELS HEFE OBERFLAECHEN PRAESENTATION 145
4.4.4 DISKUSSION 151
5 ZUSAMMENFASSUNG 156
6 LITERATUR 158
7 PUBLIKATIONEN 172
8 EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 173
9 DANKSAGUNG 175
10 LEBENSLAUF 176
ANHANG 177
CHARAKTERISIERUNG DES SYNTHETISIERTEN
BIOTINTYRAMIDES MITTELS LCMS SOWIE
HPLC 177
SEQUENZEN DER
ANALYSIERTEN GLUKOSE OXIDASE
KLONE 179
INHALTSVERZEICHNIS
IV
|
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