Studien zur Regulation und Funktion der Polo-Kinase Cdc5 im Zellteilungszyklus der Hefe Saccharomyces cerevisiae:
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2012
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS 5
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 10
1 ZUSAMMENFASSUNG 14
2 ABSTRACT 16
3 EINLEITUNG 18
3.1 DER ZELLTEILUNGSZYKLUS DER HEFE S. CEREVISIAE 18
3.2 REGULATION DES ZELLTEILUNGSZYKLUS IN S. CEREVISIAE 21
3.2.1 REGULATION DES ZELLTEILUNGSZYKLUS DURCH DIE ZYKLINABHAENGIGE KINASE
21
3.2.2 REGULATION DES ZELLTEILUNGSZYKLUS DURCH UBIQUITIN-VERMITTELTE
PROTEINDEGRADATION 23
3.2.2.1 DER SCF-KOMPLEX 24
3.2.2.2 ANAPHASE PROMOLING COMPLEX (APC) 25
3.2.3 REGULATION DES AUSTRITTS AUS DER MITOSE 27
3.2.3.1 DER NUKLEOLUS - ORT DER CDCL4-INAKTIVIERUNG 28
3.2.3.2 CDCL4-AKTIVIERUNG DURCH FEAR UND MEN 28
3.3 DAS SPINDELKONTROLLSYSTEM 32
3.3.1 KINETOCHORSTRUKTUR UND AKTIVIERUNG DES SAC 32
3.3.2 BILDUNG DES MCC UND APC-INHIBIERUNG 34
3.3.3 INAKTIVIERUNG DES SAC 36
3.3.4 MPSL IM SPINDELKONTROLLSYSTEM 37
3.4 CDC5 - DIE POLO-KINASE IN S. CEREVISIAE 38
3.4.1 REGULATION VON CDC5 40
3.4.2 FUNKTIONEN VON CDC5 42
4 ERGEBNISSE 45
4.1 REGULATION VON CDC5 DURCH DEN N-TERMINALEN BEREICH 45
4.2 INSTABILITAET UND LOKALISATION VON CDC5N80-GFP 47
4.2.1 CDC5N80 IST HINREICHEND FTIR INSTABILITAET UND LOKALISATION IM
ZELLKERN 47
4.2.2 KEN-BOX UND D-BOXEN TRAGEN ZUR INSTABILITAET VON CDC5 BEI 50
4.2.3 KERNLOKALISATION VON CDC5N80-GFP IST NOTWENDIG FUER INSTABILITAET 55
5
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INHALTSVERZEICHNIS
4.2.4 DEGRADATION VON CDC5N80-GFP IST IM NUKLEOPLASMA EFFEKTIVER 59
4.3 REGULATION VON CDC5 DURCH CDK I -ABHAENGIGE PHOSPHORYLIERUNG 63
4.3.1 KOMPLEMENTATION VON CDC5-D DURCH CDCSPML/2 IST UNVOLLSTAENDIG 63
4.3.2 MUTATION DER N-TERMINALEN PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN HAT KEINEN
EINFLUSS AUF
DIE INSTABILITAET VON CDC5 68
4.3.3 MUTATION DER N-TERMINALEN PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN HAT KEINEN
EINFLUSS AUF
DIE LOKALISATION VON CDC5 69
4.3.4 GENETISCHE INTERAKTIONEN VON CDC5MPI/2 71
4.3.4.1 SYNTHETISCHE LETALITAET VON CDC5PML/2 MIT CLB2-A UND CDC14 *
10
72
4.3.4.2 UEBEREXPRESSION VON CDCL4 SUPPRIMIERT DEN CDCSPM//2-PHAENOTYP 73
4.3.5 CDC
14-FREISETZUNG IST IN DER C FCJ/?M//2-MUTANTE BEEINTRAECHTIGT 75
4.3.6 MUTATION DER N-TERMINALEN PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN HAT EINEN
EINFLUSS AUF DIE
KINASE-AKTIVITAET VON CDC5 IN VIVO 77
4.4 CDC5 IM SPINDELKONTROLLSYSTEM 82
4.4.1 CDC5 IST EIN GEGENSPIELER DES SPINDELKONTROLLSYSTEMS 83
4.4.2 ERHOEHTE MENGEN VON CDC5 LOESEN DEN MCC AUF 85
4.4.3 ERHOEHTE MENGEN VON CDC5 VERHINDERN NICHT DIE INTERAKTION VON MADL
MIT
MAD2 87
4.4.4 ERHOEHTE MENGEN VON CDC5 BEEINFLUSSEN DIE KINETOCHOR-LOKALISATION
DER SAC-
KOMPONENTEN 88
4.4.4.1 ERHOEHTE MENGEN VON CDC5 VERRINGERN DIE KINETOCHOR-LOKALISATION
VON
MADL 89
4.4.4.2 ERHOEHTE MENGEN VON CDC5 VERRINGERN DIE KINETOCHOR-LOKALISATION
VON
MAD2 UND BUB3 92
4.4.4.3 CDC20 CO-LOKALISIERT MIT UNBESETZTEM KINETOCHOR 95
4.4.5 KINETOCHOR-LOKALISATION VON SAC-KOMPONENTEN IST VONEINANDER
ABHAENGIG . 96
4.4.6 POTENTIELLE ZIELPROTEINE VON CDC5 IM SPINDELKONTROLLSYSTEM 99
4.4.6.1 NDC80 99
4.4.6.2 SLKL 9 100
4.4.6.3 MPSL 102
4.4.7 REGULATION VON CDC5 IM SPINDELKONTROLLSYSTEM 105
5 DISKUSSION 107
5.1 REGULATION VON CDC5 DURCH DIE N-TERMINALE DOMAENE (N80) 107
5.1.1 N80 VERMITTELT INSTABILITAET UND KEMLOKALISATION 107
6
INHALTSVERZEICHNIS
5.1.2 KERNLOKALISATION VERMITTELT INSTABILITAET IN G1 110
5.1.3 N80 STIMULIERT KINASE-AKTIVITAET VON CDC5 IN VIVO 112
5.1.4 N-TERMINALE DOMAENE IST IN HEFEN KONSERVIERT 115
5.2 CDC5 - EIN NEGATIVER REGULATOR DES SPINDELKONTROLLSYSTEMS 116
5.2.1 MCC-BILDUNG AM UNBESETZTEN KINETOCHOR 116
5.2.2 INAKTI
VIERUNG DES SAC DURCH CDC5 117
5.2.3 WIRKUNGSWEISE VON CDC5 IM SAC 119
6 METHODEN 122
6.1 ARBEITEN MIT BAKTERIEN 122
6.1.1 KULTIVIERUNG VON DH5A-ZELLEN 122
6.1.2 TRANSFORMATION VON DH5A-ZELLEN 122
6.1.2.1 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER DH5O-ZELLEN 122
6.1.2.2 TRANSFORMATION VON ELEKTROKOMPETENTEN ZELLEN MITTELS
ELEKTROPORATION.. 122
6.2 ARBEITEN MIT DER HEFE S. CEREVISIAE 123
6.2.1 KULTIVIERUNG VON HEFESTAEMMEN IN FLILSSIGMEDIUM 123
6.2.2 SYNCHRONISATION VON HEFEKULTUREN 123
6.2.2.1 SYNCHRONISATION DURCH DAS PAARUNGSPHEROMON A-FAKTOR 124
6.2.2.2 SYNCHRONISATION DURCH DAS SPINDELGIFT NOCODAZOL 124
6.2.2.3 SYNCHRONISATION DURCH DIE DELETION VON CDC20 124
6.2.3 AUFBEWAHRUNG VON HEFESTAEMMEN 125
6.2.4 KREUZUNG HAPLOIDER HEFESTAEMME 125
6.2.5 SPORULATION DIPLOIDER HEFEZELLEN UND TETRADENANALYSE 125
6.2.6 HEFETRANSFORMATION NACH DER LITHIUMACETAT-METHODE 126
6.2.7 INTEGRATION VON PLASMID-DNA INS HEFEGENOM 127
6.2.7.1 INTEGRATION AM MAIKERGEN MITTELS INTEGRATIVEM PLASMID 127
6.2.7.2 INTEGRATION AM MARKERGEN MITTELS DISINTEGRATOR PLASMID 127
6.2.8 WACHSTUMSTEST VON HEFESTAEMMEN MITTELS VERDUENNUNGSREIHE 129
6.3 FIXIERUNG, DURCHFLUSSZYTOMETRIE UND MIKROSKOPIE VON HEFEZELLEN 129
6.3.1 ETHANOLFIXIERUNG VON HEFEZELLEN 129
6.3.2 DNA-FAERBUNG MIT SYTOX GREEN UND DURCHFLUSSZYTOMETRIE 129
6.3.3 MIKROSKOPIE VON LEBENDEN ZELLEN 130
6.4 GENETISCHE UND MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 131
6.4.1 PRAEPARATION VON GENOMISCHER DNA AUS HEFEZELLEN 131
6.4.2 POLYMERASEKETTENREAKTION 132
7
INHALTSVERZEICHNIS
6.4.2.1 PCR ZUR AMPLIFIKATION VON DNA-FRAGMENTEN 132
6.4.2.2 PCR ZUR GENOMMANIPULATION 133
6.4.2.3 GEZIELTE MUTAGENESE EINES GENS MITTELS PCR 134
6.4.2.4 PAARUNGSTYP-BESTIMMUNG MITTELS KOLONIE-PCR 135
6.4.3 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA 136
6.4.4 GELELEKTROPHORESE VON DNA 136
6.4.5 AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN 137
6.4.5.1 DNA-EXTRAKTION AUS AGAROSEGELEN 137
6.4.5.2 AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN NACH PCR ODER
RESTRIKTIONSVERDAU. 137
6.4.6 LIGATION 137
6.4.7 PLASMIDPRAEPARATION AUS E. COLI 138
6.4.7.1 PLASMIDSCHNELLISOLIERANG 138
6.4.7.2 SAEULENREINIGUNG VON PLASMID-DNA 138
6.4.8 BESTIMMUNG DER KONZENTRATION UND DES REINHEITSGRADS EINER
DNA-LOESUNG 138
6.4.9 SEQUENZIERUNG 138
6.5 PROTEINANALYTISCHE METHODEN 139
6.5.1 HERSTELLUNG VON PROTEINLYSATEN AUS HEFEZELLEN 139
6.5.2 PROTEINKONZENTRATIONS-BESTIMMUNG NACH BRADFORD 139
6.5.3 IMMUNPRAEZIPITATION 139
6.5.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 140
6.5.5 WESTEMBLOT UND IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS VON PROTEINEN 141
7 MATERIAL 143
7.1 HEFESTAEMME 143
7.2 PLASMIDE UND VEKTOREN 151
7.3 OLIGONUKLEOTIDE 153
7.4 NUKLEINSAEUREN 156
7.5 ENZYME UND PROTEINE 156
7.6 ANTIKOERPER UND SEREN 157
7.6.1 PRIMAERE ANTIKOERPER UND SEREN 157
7.6.2 SEKUNDAERE ANTIKOERPER 157
7.7 CHEMIKALIEN 158
7.8 SONSTIGE MATERIALIEN 160
7.9 GERAETE 161
7.10 SOFTWARE UND DATENBANKEN 163
8
INHALTSVERZEICHNIS
7. U MEDIEN, PUFFER UND LOESUNGEN 164
7.11.1 BAKTERIENMEDIEN 164
7.11.2 HEFEMEDIEN 165
7.11.3 PUFFER UND LOESUNGEN 166
8 LITERATURVERZEICHNIS 170
9 ANHANG 182
9.1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 182
9.2 TABELLENVERZEICHNIS 183
LEBENSLAUF 184
DANKE 186
9
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| spelling | Arnold, Lea 1983- Verfasser (DE-588)1047248077 aut Studien zur Regulation und Funktion der Polo-Kinase Cdc5 im Zellteilungszyklus der Hefe Saccharomyces cerevisiae von Lea Arnold 2012 186 Bl. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Regensburg, Univ., Diss., 2013 Mit einer Zssfassung in engl. Sprache Regulation (DE-588)4049075-0 gnd rswk-swf Zellzyklus (DE-588)4129960-7 gnd rswk-swf Saccharomyces cerevisiae (DE-588)4178812-6 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Saccharomyces cerevisiae (DE-588)4178812-6 s Zellzyklus (DE-588)4129960-7 s Regulation (DE-588)4049075-0 s b DE-604 Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:355-epub-278256 http://epub.uni-regensburg.de/27825/ Verlag kostenfrei Volltext https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:355-epub-278256 Resolving-System DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=027077547&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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