Auswirkungen der Änderung von LDH A auf die Funktion der extrazellulären Matrix bei malignen Gliomzellen:
Gespeichert in:
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| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Regensburg
Univ. Regensburg
2013
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| adam_text | INHALT
1 EINLEITUNG 1
1.1 MALIGNE GLIOME 1
1.2 METABOLISMUS VON GLIOMEN 5
1.2.1 DER WARBURG EFFEKT 5
1.2.2 LAKTAT DEHYDROGENASE TYP A (LDH A) ALS SCHLUESSELENZYM DER
GLYKOLYSE 8
1.2.3 LAKTAT UND SEINE ROLLE IN DER TUMORBIOLOGIE 8
1.3 DIE EXTRAZELLULAERE MATRIX 9
1.3.1 ALLGEMEINES 9
1.3.2 WICHTIGE MATRIXMOLEKUELE BEI GLIOMEN 11
1.3.2.1 LAMININE 11
1.3.2.2 FIBRONECTIN (FN) 11
1.3.2.3 KOLLAGENE 12
1.3.2.4 VITRONECTIN 12
1.3.2.5 HYALURONSAEURE 12
1.3.2.6 MYELIN 13
1.3.2.7 TENASCIN C (TNC C) 13
1.3.2.8 ZELLADHAESIONSMOLEKUELE 14
1.3.2.9 PROTEINASEN 15
1.4 THROMBOSPONDIN-1 (THBS-1) 16
1.4.1 ALLGEMEINES UND AUFBAU DES MOLEKUELS 16
1.4.2 WICHTIGE FUNKTIONEN VON THBS-1 BEI MALIGNEN GLIOMEN 19
1.4.2.1 ANGIOGENESE 19
1.4.2.2 AKTIVIERUNG VON TRANSFORMING GROWTH FACTOR BETA (TGF SS) 19
1.5 TRANSFORMING GROWTH FACTOR BETA (TGF B) 19
1.5.1 ALLGEMEINES 19
1.5.2 DIE WIRKUNGEN VON TGF-BETA BEI MALIGNEN GLIOMEN 21
1.5.2.1 PROLIFERATION 21
1.5.2.2 MIGRATION UND INVASION 21
1.5.2.3 ANGIOGENESE 22
1.5.2.4 IMMUNSUPPRESSION 22
V
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1.6 AKTIVIERUNG VON TGF-BETA DURCH THBS-1 22
2 ZIELSETZUNG 24
3 MATERIAL UND METHODEN 25
3.1 MATERIALIEN 25
3.1.1 AUFSTELLUNG DER VERWENDETEN MATERIALIEN 25
3.1.2 AUFSTELLUNG DER VERWENDETEN ZELLLINIEN 27
3.1.3 KULTURMEDIEN 28
3.1.3.1 VOLLMEDIUM 28
3.1.3.2 EINFRIERMEDIUM 28
3.1.3.3 TRANSFEKTIONSMEDIUM 28
3.1.4 PUFFER UND LOESUNGEN 28
3.1.4.1 AGAROSE- GELELEKTROPHORESE 28
3.1.4.2 PROTEINISOLIERUNG 28
3.1.4.3 POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 29
3.1.4.4 WESTERN BLOT 29
3.1.5 VERWENDETE SIRNAS 30
3.1.6 VERWENDETE PRIMER 30
3.1.7 VERWENDETE ANTIKOERPER 31
3.1.8 SYNTHETISCHES THBS-1 32
3.2 METHODEN 32
3.2.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 32
3.2.1.1 AUFTAUEN DER ZELLEN 32
3.2.1.2 PASSAGIEREN; BESTIMMUNG DES WACHSTUMSVERHALTENS 33
3.2.1.3 KRYOKONSERVIERUNG 33
3.2.1.4 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL IN DER NEUBAUER ZAEHLKAMMER 33
3.2.1.5 TRANSIENTE TRANSFEKTION MIT SMALL INTERFERING RNA 34
3.2.1.6 ENTNAHME VON ZELLKULTURUEBERSTAENDEN FUER ELISA 35
3.2.1.7 PROLIFERATIONSASSAY 35
3.2.1.8 SCRATCH MIGRATIONSASSAY 35
3.2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 36
3.2.2.1 RNA-ISOLIERUNG 36
VI
3.2.2.2 BESTIMMUNG DER RNA-KONZENTRATION 36
3.2.2.3 CDNA SYNTHESE DURCH REVERSE TRANSKRIPTION 37
3.2.2.4 KONVENTIONELLE POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 37
3.2.2.5 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 38
3.2.2.6 REAL-TIME QUANTITATIVE PCR 39
3.2.2.7 UNTERSUCHUNG DER GENEXPRESSION MIT HILFE VON RNA-MICROARRAYS 40
3.2.2.7.1 VORBEREITUNG VON RNA FUER MICROARRAYS 40
3.2.2.7.2 ARRAY-HYBRIDISIERUNG 41
3.2.2.7.3 ARRAY-AUSWERTUNG 41
3.2.2.8 PROTEIN-BIOCHEMISCHE METHODEN 42
3.2.2.8.1 PROTEINGEWINNUNG 42
3.2.2.8.2 PROTEINBESTIMMUNG 42
3.2.2.8.3 PROBENVORBEREITUNG 43
3.2.2.8.4 AUFTRENNUNG VON PROTEINEN IM SDS-POLYACRYLAMIDGEL (SDS-PAGE)
43
3.2.2.8.5 WESTERN BLOT 44
3.2.2.8.6 TGF-BETA2-ELISA 45
4 ERGEBNISSE 46
4.1 SUPPRESSION VON LDH A MITTELS SILDH A IN GBM-ZELLEN 46
4.1.1 UNTERSUCHUNG DERTRANSFEKTIONSEFFIZIENZ 46
4.1.2 NACHWEIS DER SUPPRESSION VON LDH A AUF MRNA-
UND PROTEIN-EBENE 47
4.1.2.1 FUNKTIONELLE EFFEKTE DER SUPPRESSION VON LDH A BEI GBM-ZELLEN 48
4.1.2.1.1 VERMINDERUNG DER LAKTAT-KONZENTRATION IM ZELLKULTUR UEBERSTAND
48
4.1.2.1.2 VERMINDERUNG DER MIGRATION 49
4.1.2.1.3 VERMINDERUNG DERTGF-BETA2 KONZENTRATION 50
4.2 UNTERSUCHUNG RELEVANTER EXTRAZELLULAERER MATRIX-MOLEKUELE 51
4.2.1 AUSWAHL EINES GEEIGNETEN ZELLULAEREN MODELLS FUER MRNA-MICROARRAYS
51
4.2.2 UNTERSUCHUNG DER GENEXPRESSION VON SILDH A TRANSFIZIERTEN ZELLEN
MIT HIL-
4.2.3 FE VON RNA-MICROARRAYS 53
4.2.4 VALIDIERUNG DER RNA-MICROARRAY ERGEBNISSE MITTELS QRT-PCR 59
4.2.3.1 DESIGN VON PRIMERN FUER REAL TIME QUANTITATIVE PCR 59
4.2.3.2 ERGEBNISSE DER QRT-PCR UNTERSUCHUNG RELEVANTER ECM MOLEKUE-
VII
LE DER RNA-MICROARRAYS 61
4.2.4 AUSWAHL VON THBS-1 ALS RELEVANT DURCH SILDH A REGULIERTES
EXTRAZELLU
LAERES MATRIX-MOLEKUEL 63
4.2.4.1 NACHWEIS DER NEGATIVEN REGULATION VON THBS-1 NACH SILDH A
BEHAND
LUNG IN WEITEREN GBM-ZELMINIEN 64
4.2.4.2 SUPPRESSION DER PROTEIN-KONZENTRATION VON THBS-1 DURCH SI
LDH A TRANSFEKTION 65
4.3 EFFEKT VON MILCHSAEURE, SALZSAEURE UND NATRIUMLAKTAT AUF
GLIOMZELLLINIEN 66
4.3.1 DEFINIEREN DER VERSUCHSBEDINGUNGEN 66
4.3.2 INDUKTION VON THBS-1 DURCH LAKTAT AUF MRNA-EBENE 67
4.3.3 INDUKTION VON THBS-1 DURCH LAKTAT AUF PROTEIN-EBENE 69
4.4 RE-INDUKTION DER THBS-1 MRNA-EXPRESSION DURCH LAKTAT BEI SILDH A
TRANSFI-
ZIERTEN GBM-ZELLEN 69
4.5 SPEZIFISCHE SUPPRESSION VON THBS-1 IN GBM-ZELLEN 70
4.5.1 DESIGN VON GEEIGNETER SIRNA GEGEN THBS-1 71
4.5.2 ETABLIERUNGGEEIGNETERTRANSFEKTIONSBEDINGUNGEN FUER SITHBS-1 71
4.5.2.1 REGULATION VON THBS-1 AUF MRNA-EBENE 71
4.5.2.2 REGULATION VON THBS-1 AUF PROTEINEBENE 73
4.5.3 AUSWIRKUNGEN DER SUPPRESSION VON THBS-1
AUF DIE FUNKTION VON GNOM
ZELLEN 75
4.5.3.1 PROLIFERATION 75
4.5.3.2 MIGRATION 76
4.5.3.3 AKTIVIERUNG VON TG F-BETA2 77
4.6 ZUGABE VON SYNTHETISCHEM THBS-1 ZU SILDH A TRANSFIZIERTEN ZELLEN 78
4.6.1 DEFINITION DER VERSUCHSBEDINGUNGEN 79
4.6.2 FUNKTIONELLE EFFEKTE 79
4.6.2.1 AKTIVIERUNG VON TGF-BETA2 BEI SILDH A TRANSFIZIERTEN ZELLEN 79
4.6.2.2 AKTIVIERUNG DER MIGRATION VON SILDH A TRANSFIZIERTEN ZELLEN 80
5 DISKUSSION 82
5.1 APPLIKATION VON SILDH A BEI HUMANEN GLIOMZELLEN 82
5.2 FUNKTIONELLE EFFEKTE DER TRANSFEKTION MIT SILDH A 83
VIII
5.2.1 MIGRATION 83
5.2.2 REGULATION VON TGF-BETA2 84
5.3 DIE EXTRAZELLULAERE MATRIX ALS VERMITTLER VON ADHAESION, MIGRATION UND
INVA
SION BEI MALIGNEN GLIOMEN 85
5.3.1 UNTERSUCHUNG DER MRNA-EXPRESSION VON SILDH A TRANSFIZIERTEN ZELLEN
MIT HIL
FE VON RNA-MICROARRAYS 86
5.3.2 VALIDIERUNG DER ERGEBNISSE DER RNA-MICROARRAYS MIT HILFE VON
QRT-PCR 91
5.4 THBS-1 ALS RELEVANT REGULIERTES EXTRAZELLULAERES MATRIX-MOLEKUEL NACH
SI
LDH A TRANSFEKTION 92
5.5 THBS-1 ALS
SIGNIFIKANT REGULIERTES EXTRAZELLULAERES MATRIX-MOLEKUEL NACH MILCH
SAEURE-ZUGABE 93
5.6 REGULATION DER THBS-1 EXPRESSION MIT HILFE VON SIRNA UND SYNTHETI
SCHEM THBS-1 96
5.6.1 AUSWIRKUNGEN DER REGULATION VON THBS-1 AUF DIE FUNKTION VON GLIOM-
ZELLEN 96
5.6.1.1 PROLIFERATION 97
5.6.1.2 MIGRATION UND MALIGNE PROGRESSION 97
5.6.1.3 AKTIVIERUNG VON TGF-BETA2 99
5.7 THBS-1 ALS
VERMITTLER ZWISCHEN METABOLISMUS UND MIGRATION VON GLIOMZELLEN...LOO
5.8 AUSBLICK 102
6 ZUSAMMENFASSUNG 106
7 ANHANG 108
IX
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