Neddylierung in Arabidopsis thaliana: Charakterisierung eines Inhibitors und eines neuen Substrats
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2013
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adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS IV
TABELLENVERZEICHNIS V
ABKUERZUNGEN VI
ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 2
1 EINLEITUNG 3
1.1 DAS UBIQUITIN-PROTEASOM-SYSTEM 4
1.2 NEDD8- EIN UBIQUITIN-AEHNLICHES PROTEIN 5
1.3 MLN4924- EINE NEUES MEDIKAMENT GEGEN KREBS 8
1.4 SIGNALWEGE VON PHYTOHORMONEN UND DES LICHTS 9
1.5 MD-2-RELATED LIPID-RECOGNITION DOMAIN CONTAINING PROTEINS 13
1.6 ER BODIES UND IHRE BIOLOGIE 14
2 MATERIAL UND METHODEN 17
2.1 MATERIAL 17
2.1.1 BAKTERIENSTAEMME 17
2.1.2 PFLANZENLINIEN UND MUTANTEN 17
2.1.3 ANTIKOERPER 18
2.1.4 PRIMER 19
2.1.5 VEKTOREN 20
2.1.6 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 21
2.1.6.1 CHEMIKALIEN 21
2.1.6.2 ENZYME UND KITS 22
2.1.6.3 MARKER 23
2.2 METHODEN 24
2.2.1 GENERELLE PFLANZENARBEITEN 24
2.2.1.1 SAMENSTERILISIERUNG UND WACHSTUMSBEDINGUNGEN 24
2.2.1.2 PFLANZENTRANSFORMATION 24
2.2.1.3 SELEKTION TRANSGENER PFLANZENLINIEN 24
2.2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 25
2.2.2.1 PCR 25
2.2.2.2 KLASSISCHE KLONIERUNG 25
2.2.2.3 KLONIERUNG MIT DER GATEWAY-TECHNOLOGIE 26
I
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2.2.4 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN 27
2.2.2.5 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS PFLANZEN 27
2.2.2.6 RNA-EXTRAKTION AUS PFLANZEN 27
2.2.2.7 CDNA-SYNTHESE 28
2.2.2.8 QUANTITATIVE REAL-TIME-PCR 28
2.2.2.9 YEAST TWO-HYBRID 28
2.2.3 BIOCHEMISCHE METHODEN 29
2.2.3.1 PROTEINEXTRAKTION 29
2.2.3.2 IMMUNOPRAEZIPITATION 29
2.2.3.3 PROTEINAUFREINIGUNG MIT DEM
STREPTAVIDIN/BIOTIN-SYSTEM 29
2.2.3.4 TRYPTISCHER VERDAU IM GEL UND ELUTION DER PEPTIDE 30
2.2.3.5 MASSENSPEKTROMETRIE 30
2.2.3.6 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 30
2.2.3.7 WESTEM-BLOT 30
2.2.4 PHYSIOLOGISCHE EXPERIMENTE 31
2.2.4.1 PHYSIOLOGISCHE EXPERIMENTE 31
2.2.4.2 BEHANDLUNG MIT HORMONEN, INHIBITOREN UND ANDEREN SUBSTANZEN 31
2.2.5 HISTOLOGISCHE UND ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 31
2.2.5.1 GUS-FAERBUNG 31
2.2.5.2 KONFOKALE LASER-SCANNING-MIKROSKOPIE 32
2.2.5.3 SUBZELLULAERE FRAKTIONIERUNG 32
2.2.5.4 AUFREINIGUNG VON VAKUOLEN 32
2.2.6 PHYTOPATHOLOGISCHE METHODEN 32
2.2.7 BIOINFORMATISCHE METHODEN 32
2.2.7.1 SEQUENZ- UND PHYLOGENETISCHE ANALYSEN 32
2.2.7.2 3D-MODELLIERUNG 33
3 ERGEBNISSE 34
3.1 MLN4924 IST EIN
EFFIZIENTER INHIBITOR DER NEDD8-AKTIVIERUNG IN PFLANZEN 34
3.1.1 STRUKTURVORHERSAGE DER MLN4924-BINDUNG AN ECR1 34
3.1.2 SPEZIFISCHE INHIBITION DER NEDDYLIERUNG IN ARABIDOPSIS THALIANA
DURCH
MLN4924 35
3.1.3 DER AUXIN-INSENSITIVE PHAENOTYP DER NEDDYLIERUNGSMUTANTEN KANN MIT
MLN4924 HERVORGERUFEN WERDEN 37
3.1.4 MLN4924 STABILISIERT DIE
SUBSTRATE WEITERER CRLS 39
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.5 MLN4924 INHIBIERT DIE NEDDYLIERUNG IN WEITEREN PFLANZENSPEZIES 42
3.1.6 NEDD8 SCHEINT NEBEN DEN CULLINEN WEITERE SUBSTRATE IN ARABIDOPSIS
THALIANA
ZU HABEN 43
3.2 DAS MD-2-RELATED LIPID-RECOGNITION DOMAIN CONTAINING PROTEIN ML3 IST
EIN NEUES
SUBSTRAT DER NEDDYLIERUNG 45
3.2.1 IDENTIFIZIERUNG NEUER NEDD8-SUBSTRATE IN ARABIDOPSIS 45
3.2.2 ML3 INTERAGIERT WAHRSCHEINLICH MIT NEDD8 UND UBIQUITIN 49
3.2.3 ML3 GEHOERT ZUR FAMILIE DER MD-2-RELATED LIPID-RECOGNITION DOMAIN
PROTEINE 51
3.2.4 IDENTIFIZIERUNG VON M/3-MUTANTEN 54
3.2.5 ML3 LOKALISIERT IN DIE VAKUOLE UND IN ER BODIES 55
3.2.6 REGULATION DER MZJ-EXPRESSION DURCH NAI1 57
3.2.7 ML3 HAT EINE ROLLE IN DER ABWEHR MIKROBIELLER PATHOGENE 60
4 DISKUSSION.. ........ ..... ....... ..... .... ......* 62
4.1 MLN4924- INHIBITOR DER NEDDYLIERUNG IN PFLANZEN 62
4.1.1 SPEZIFISCHE INHIBITION DER NEDD8-AKTIVIERUNG DURCH MLN4924 62
4.1.2 DIE WIRKUNG VON MLN4924 AUF HORMONSIGNALWEGE 63
4.1.3 INHIBITION WEITERER CRLS DURCH MLN4924 65
4.1.4 ANWENDUNGEN VON MLN4924 IN DER PFLANZENFORSCHUNG 66
4.1.5 IDENTIFIZIERUNG NEUER NEDD8-SUBSTRATE 67
4.2 ML3 IST EIN NEUES NEDD8-SUBSTRAT IN ARABIDOPSIS 68
4.2.1 ML3 IST EIN BRASSICALES-SPEZIFISCHES ML-PROTEIN 68
4.2.2 ML3 WIRD DURCH NEDD8 UND UBIQUITIN MODIFIZIERT 69
4.2.3 DIE INTERAKTION ML3S MIT NEDD8 UND UBIQUITIN 70
4.2.4 DIE SUBZELLULAERE LOKALISIERUNG ML3S 71
4.2.5 ML3 IST MIT DER ER BODY-BIOLOGIE ASSOZIIERT 73
4.2.6 ML3 SPIELT EINE ROLLE IN DER PATHOGENABWEHR 74
4.2.7 GLUKOSINOLATE UND ML3 75
4.3 SCHLUSSFOLGERUNG 76
5 QUELLENVERZEICHNIS 78
DANKSAGUNG. 91
APPENDIX 93
HAKENJOS ET AL., 2011
HAKENJOS ET AL., 2013
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