Der molekulare Wirkmechanismus von Legionella-pneumophila-Glukosyltransferasen:
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2013
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adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
A EINLEITUNG 1
A 1 LEGIONELLA PNEUMOPHILA 1
A 1.1 PARASIT-WIRT-BEZIEHUNG 2
A 1.2 LEBENSZYKLUS VON LEGIONELLA PNEUMOPHILA 3
A 1.3 LEGIONELLA-
EFFEKTORPROTEINE 5
A 2 LEGIONELLA PNEUMOP/J/ /O-GLUKOSYLTRANSFERASEN 8
A 2.1 DIE FAMILIE DER L. PNEUMOPHILA-GLUKOSYLTRANSFERASEN 8
A 2.2 EUKARYONTISCHE SUBSTRATE DER /.EG/ONE//O-GLUKOSYLTRANSFERASEN 10
A 3 DER EUKARYONTISCHE ELONGATIONSFAKTOR 1A (EEFLA) 11
A3.1 DIE FUNKTIONEN VON EEFLA 11
A 3.2 EINBLICKE IN DIE EEFLA-STRUKTUR 14
A 3.3 EINFLUSS AUF DIE PROTEINBIOSYNTHESE DURCH MODIFIKATIONEN DES EEFLA
17
B ZIELE DER ARBEIT 19
C MATERIAL & METHODEN 20
C1 BEZUGSQUELLEN VON CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIAL 20
C 2 PUFFER, LOESUNGEN UND MIKROBIOLOGISCHE MEDIEN 23
C 2.1 PUFFER, MEDIEN UND LOESUNGEN 23
C 3 VERWENDETE GERAETE 25
C 4 PLASMIDE UND STAEMME 26
C 5 ZELLKULTUR 27
C 5.1 VERWENDETE ZELLLINIEN 27
C 5.2 PASSAGIEREN VON ZELLEN 27
C6 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 27
C6.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION 27
C 6.2 AUFREINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN UND DNA-FRAGMENTEN 28
C 6.3 ALKOHOLFAELLUNG 28
C 6.4 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 28
C 6.5 KONZENTRATIONS- UND REINHEITSBESTIMMUNG VON DNA 29
C 6.6 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 29
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INHALTSVERZEICHNIS
C 6.7 ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSE-GELEN 29
C 6.8 VERDAU VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 29
C 6.9 DNA-TRANSFORMATION IN CHEMISCH-KOMPETENTE E. COLI 30
C 6.10 ZIELGERICHTE MUTAGENESE 30
C 6.11 SEQUENZIERUNG VON DNA 30
C7 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODE 31
C 7.1 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IN E. COLI 31
C 7.2 AUFREINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE AUS E. COLI 31
C 7.3 AUFREINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE AUS SACCHAROMYCES CEREVISIAE
31
C 7.4 PROTEINAUFREINIGUNG DES NATIVEN HEFE- BZW. MAUS-EEFLA 32
C 7.5 GELFILTRATIONS-CHROMATOGRAPHIE 32
C 7.6 PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG 33
C 7.7 TCA-FAELLUNG 33
C 7.8 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 33
C 7.9 WESTERN-BLOT 33
C 7.10 STRIPPING VON WESTERN-BLOTS 34
C 7.11 KULTIVIERUNG VON LEGIONELLA PNEUMOPHILA 34
C 7.12 BESTIMMUNG DER GLUKOHYDROLASE-AKTIVITAET 34
C 7.13 ISOTHERME TITRATIONSKALORIMETRIE 35
C7.14 AMINOACYL-TRNA-SYNTHESE 35
C 7.15 PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION 36
C 7.16 GLUKOSYLIERUNGSREAKTION 36
C 7.17 INHIBIERUNG DER TRANSLATION 36
C 7.18 AA-TRNA-PROTEKTIONSVERSUCH 37
C 7.19 IN-VIVO-MODIFIKATION DURCH LEGIONELLA UND ISOLATION DES
GLUKOSYLIERTEN EEFLA 37
C 7.20 PROBENVORBEREITUNG FUER MASSENSPEKTROMETRIE 37
C 7.21 MASSENSPEKTROMETRIE 38
C 7.22 HEFE-TRANSFORMATION 38
C 7.23 ZYTOTOXIZITAET VON LGT IN S. CEREVISIAE 39
C7.24 KO-SEDIMENTATIONSVERSUCH 39
C 7.25 RIBOSOMENPROFIL 40
INHALTSVERZEICHNIS
C 7.26 IN-VITRO-OLIGO-PHENYLALANIN-SYNTHESE 40
C 7.27 RIBOSOMALE A-STELLEN-BINDUNG DES TERNAERKOMPLEXES 41
C 7.28 GTP-HYDROLYSE 41
C 8 PHYSIKALISCHE METHODEN 42
C 8.1 AFFINITAETSBESTIMMUNG VON MANT-NUKLEOTIDEN ZU EEFLA MITTELS
FLUORIMETRIE 42
C 8.2 STOPPED-FLOW-MESSUNGEN 42
C 9 STATISTIK 43
D ERGEBNISSE 44
D 1 IN-VIVO-GLUKOSYLIERUNG VON EEFLA DURCH LEGIONELLA PNEUMOPHILA 44
D 2 VERGLEICH DER AKTIVITAETEN DER GLUKOSYLTRANSFERASEN LGTL, LGT2 UND
LGT3 46
D 2.1 HEMMUNG DER PROTEINBIOSYNTHESE DURCH LGTL, LGT2 UND LGT3 46
D 2.2 GLUKOSYLTRANSFERASE-AKTIVITAET VON LGTL, 2 UND 3 47
D 3 TERNAERKOMPLEX ALS BONAFIDES SUBSTRAT DER LGTS 48
D 3.1 IDENTIFIZIERUNG VON AA-TRNA UND GTP ALS NOTWENDIGE FAKTOREN FUER
DIE
GLUKOSYLIERUNG DURCH LGTS 48
D 3.2 EEFLA IN SEINER GESAMTEN LAENGE IST ESSENTIELL FUER DIE
AA-TRNA-ABHAENGIGE
GLUKOSYLIERUNG 55
D 3.3 AMINOACYL-TRNA INTERAGIERT NICHT DIREKT MIT
LEGIONELLA-GLUKOSYLTRANSFERASEN 57
D 3.4 DIE AKZEPTORAMINOSAEURE SERIN-53 ALS EINZIGE GLUKOSYLIERUNGSSTELLE
IN EEFLA 59
D 3.5 QUANTITATIVE GLUKOSYLIERUNG VON EEFLA IM TERNAEREN KOMPLEX 59
D 4 KONSEQUENZEN DER EEFLA-GLUKOSYLIERUNG 61
D 4.1 VERAENDERUNG DER NUKLEOTID-AFFINITAET NACH GLUKOSYLIERUNG VON EEFLA
61
D 4.2 DIE INTERAKTION VON EEFLA MIT EEFIBA IST NACH GLUKOSYLIERUNG NICHT
GEHEMMT 62
D 4.3 DIE GLUKOSYLIERUNG HAT KEINEN EINFLUSS AUF DIE BINDUNG DER AA-TRNA
AN EEFLA 63
D 4.4 INHIBIERUNG DER OLIGO-[
14
C]PHE-SYNTHESE DURCH GLUKOSYLIERTEN EEFLA 65
D 4.5 DIE AFFINITAET DES GLUKOSYLIERTEN EEFLA ZUM RIBOSOM BLEIBT
UNVERAENDERT 67
D 4.6 DIE GTPASE-AKTIVITAET BLEIBT NACH GLUKOSYLIERUNG DES SERIN-53
UNVERAENDERT 68
D 4.7 ZYTOTOXIZITAET VON LGTL IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE 68
D 4.8 KEINE KO-SEDIMENTATION VON GLUKOSYLIERTEM EEFLA MIT RIBOSOMEN 70
D 4.9 RIBOSOMENPROFIL VON LGTL-EXPRIMIERENDEN HEFEZELLEN 71
D 4.10 PHYSIOLOGISCHE MODIFIKATION VON HEFE-EEFLA AN SERIN-53 73
D 5 STRUKTUR-FUNKTIONSANALYSE DER GLUKOSYLTRANSFERASE LGTL 78
INHALTSVERZEICHNIS
D 5.1 STRUKTURBESCHREIBUNG 78
D 5.2 BESCHREIBUNG FUNKTIONELLER AMINOSAEUREN IN LGTL 79
D 5.3 THERMODYNAMISCHE UND STRUKTURELLE CHARAKTERISIERUNG DER
LGTL-MUTANTEN 83
E DISKUSSION 86
E 1 EEFLA* GTP*AA-TRNA-TERNAERKOMPLEX ALS TATSAECHLICHES SUBSTRAT DER LGTS
86
E 1.1 STRUKTURELLE VERAENDERUNG VON EEFLA NACH SERIN-53-GLUKOSYLIERUNG 88
E 2 ZELLULAERE KONSEQUENZEN DER EEFLA-GLUKOSYLIERUNG 91
E 2.1 AUSWIRKUNG DER EEFLA-GLUKOSYLIERUNG AUF DIE ELONGATION DER
PROTEINBIOSYNTHESE. 91
E 2.2 PHYSIOLOGISCHE MODIFIKATION DES EEFLA 94
E 2.3 EINFLUSS DER GLUKOSYLIERUNG AUF DIE INITIATION DER
PROTEINBIOSYNTHESE 98
E 3 STRUKTUR-FUNKTIONSANALYSE DER GLUKOSYLTRANSFERASE LGTL 99
E 4 ROLLE DER LGTS IN DER LEGIONELLA-PATHOGENESE 102
F AUSBLICK 104
G ZUSAMMENFASSUNG 105
H LITERATURVERZEICHNIS 107
I ANHANG 121
II VERWENDETE PRIMER 121
I 2 VERWENDETE ANTIKOERPER 122
I 3 ABKUERZUNGEN 122
J DANKSAGUNG 125
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