COMP - ein Protein der extrazellulären Matrix mit unterschiedlichen Funktionen: eine Analyse mit verschiedenen genetischen Modellen
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| adam_text | Titel: COMP - ein Protein der extrazellulären Matrix mit unterschiedlichen Funktionen
Autor: Schulz, Jan-Niklas
Jahr: 2013
Inhatsverzeichnis
/Einleitung.............................................................................................................................1
1. Die extrazelluläre Matrix der Haut........................................................................................................1
1.1 Das Kollagennetzwerk der Dermis......................................................................................................2
1.1.1 Posttranskriptionale Modifikationen und Fibrillogenese der Kollagene........................................2
1.1.2 Funktionelle Unterteilung der wichtigsten dermalen Kollagene...................................................4
1.2 Nicht-kollagene Proteine beeinflussen das Kollagennetzwerk und seine Eigenschaften.......................5
2. COMP - ein pentameres Mitglied derThrombospondin-Familie............................................................6
2.1 Die Expression von COMP und seine Interaktionspartner....................................................................6
2.2 Bisher bekannte Funktionen von COMP..............................................................................................7
2.3 Mutiertes COMP kann zu ER-Stress und Chondrodysplasien führen....................................................7
3. Die systemische Sklerodermie..............................................................................................................9
3.1 COMP ist Bestandteil von fibrotisch veränderter EZM der Haut..........................................................9
4. Fragestellung.....................................................................................................................................10
S.Strategie............................................................................................................................................11
II Material und Methoden....................................................................................................12
1. Materialien........................................................................................................................................12
1.1 Verwendete Bakterienstämme und Nährmedien..............................................................................12
1.2 Verwendete Puffer und Lösungen....................................................................................................12
1.3 Verwendete Enzyme........................................................................................................................14
1.4 Verwendete Oligonukleotide............................................................................................................14
1.5 Antikörper.......................................................................................................................................16
1.6 Geräte.............................................................................................................................................17
1.7 Verwendete Vektoren......................................................................................................................17
2. Methoden..........................................................................................................................................18
2.1 Klonierungsarbeiten.........................................................................................................................18
2.1.1 DNA-Präparation aus Bakterien und Präzipitation.....................................................................18
2.1.2 Die Polymerasekettenreaktion (PCR) als Hilfsmittel zur Klonierung............................................18
2.1.3 DNA-Restriktionsverdau............................................................................................................19
2.1.4 Die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA......................................................................19
2.1.5 Elution von DNA-Fragmenten aus dem Agarose-Gel..................................................................19
2.1.6 DNA-Dephosphorylierung.........................................................................................................20
2.1.7 DNA-Ugation............................................................................................................................20
2.1.8 Transformation von Bakterien..................................................................................................20
2.2 Proteingewinnung............................................................................................................................21
2.2.1 Proteinexpression durch Bakterien...........................................................................................21
2.2.2 Die Proteinaufreinigung über eine Säule...................................................................................21
2.2.3 Dialyse der Eluate.....................................................................................................................22
2.3 Zellkultur und Mauspräparation.......................................................................................................23
2.3.1 Fibroblasten-Isolation aus neonatalen Mäusen.........................................................................23
2.3.2 Das Einfrieren und Auftauen von Fibroblasten..........................................................................23
2.3.3 Die Zugabe von HTNC auf primäre Fibroblasten........................................................................24
2.3.4 Die Zugabe von Interleukinen auf primäre Fibroblasten............................................................24
2.3.5 Induktion von ER-Stress durch die Zugabe von TGF-ß................................................................24
2.3.6 Migrationsanalysen von primären Fibroblasten auf beschichtetem Untergrund........................24
2.3.7 Das Anlegen von ex-vivo Organkulturen....................................................................................25
2.4 Tierversuche und die Entnahme von Biopsien...................................................................................26
2.4.1 Generierung einer Fibrose durch Injektionen von Bleomycin.....................................................26
2.4.2 Die Entnahmen von Hautbiopsien.............................................................................................26
2.5 Probengewinnung und Verarbeitung................................................................................................27
2.5.1 Proteinisolierung aus Fibroblasten in Kultur und Hautbiopsien..................................................27
2.5.2 Isolierung der Gesamt-RNA aus Fibroblasten in Kultur und Hautbiopsien..................................27
2.5.3 Die Reverse Transkription.........................................................................................................28
2.5.4 Isolierung von genomischer DNA aus Mausschwanzbiopsien.....................................................28
2.6 Analysen..........................................................................................................................................28
2.6.1 Die Southern Blot-Analyse........................................................................................................28
2.6.1.1 Restriktionsverdau und Präzipitation von genomischer DNA...................................................28
2.6.1.2 DNA-Transfer mittels Southern Blot.......................................................................................29
2.6.1.3 Herstellung radioaktiv-markierter Sonden..............................................................................29
2.6.1.4 Die Detektion von DNA-Fragmenten mittels radioaktiv markierter Sonden.............................30
2.6.2 Die semiquantitative Polymerasekettenreaktion (PCR) für analytische Zwecke..........................30
2.6.3 Die quantitative Polymerasekettenreaktion (qPCR)...................................................................31
2.6.4 Genotypisierung mit Hilfe der PCR............................................................................................32
2.6.5 SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)....................................................................32
2.6.6 Coomassie Blau-Färbung...........................................................................................................33
2.6.7 Western Blot-Transfer und immunologische Protein-Analyse....................................................33
2.6.8 Übersichtsfärbungen................................................................................................................34
2.6.8.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung und die Auswertung der dermalen Schichtdicke..........................34
2.6.8.2 Sirius Rot-Färbung.................................................................................................................35
2.6.9 Immunologische Färbungen......................................................................................................36
2.6.9.1 Makrophagen-Nachweis mittels Immunfluoreszenz...............................................................36
2.6.9.2 Immunhistochemische Färbung von COMP............................................................................36
2.6.9.3 Immunhistochemische Färbung von Myofibroblasten............................................................37
2.6.10 X-Gal-Färbung zum Nachweis des Enzyms ß-Galaktosidase im Gewebe...................................37
III Ergebnisse........................................................................................................................38
1. Die Analyse der Deposition von COMP in der murinen Haut...............................................................38
1.1 COMP ist in adulter Haut von Mäusen immunhistochemisch nicht nachweisbar...............................38
1.2 COMP wird während der Morphogenese der Haarfollikel exprimiert................................................39
1.3 Die Induktion einer experimentellen Fibrose führt zur COMP-Expression in muriner Haut.................41
1.4 Die Interaktion mit COMP beeinflusst die Eigenschaften einer Kollagen I-Matrix...............................43
2. Mechanismen zur Regulation der COMP-Expression...........................................................................46
2.1 Die Regulation von COMP durch Zytokine.........................................................................................46
2.2 Die Regulation von COMP durch mechanische Kräfte.......................................................................47
3. Untersuchungen der Haut von COMP-defizienten Mäusen.................................................................49
3.1 Die supramolekulare Struktur der Haut von COMP-defizienten Tieren ist verändert..........................49
3.2 Die fibrotische Reaktion auf Bleomycin ist in COMP-defizienten Tieren verändert.............................53
3.2.1 In Abwesenheit von COMP ist die fibrotische Reaktion auf Bleomycin vermindert.....................54
3.2.2 Die fibrotische Kollagenmatrix ist in Abwesenheit von COMP verändert....................................55
3.2.3 Die Anzahl der Myofibroblasten ist in fibrotischen Läsionen COMP-defizienter Tiere reduziert.. 56
3.2.4 COMP-Defizienz beeinflusst die Zahl der Makrophagen in einer fibrotischen Dermis.................58
3.3 Primäre COMP-defiziente Fibroblasten weisen Anzeichen von ER-Stress auf.....................................59
4. Die COMP-STOP-Mauslinie.................................................................................................................61
4.1 Erzeugung der COMP-STOP-Linie......................................................................................................61
4.1.1 Klonierung und Linearisierung des Targetingvektors..................................................................62
4.1.2 Nachweis der homologen Rekombination des Targetingvektors in ES-Zellen.............................65
4.1.3 Die Generierung von Chimären Mäusen....................................................................................66
4.1.4 Integration des Konstrukts in die Keimbahn (Keimbahn-Transmission)......................................67
4.1.5 Genotypisierung der transgenen Mäuse mittels einer Multiplex-PCR.........................................69
4.2 Rekombination der LoxP-Sequenzen in vitro................................................................................70
4.2.1 Aufreinigung der HTNC.............................................................................................................71
4.2.2 Das COMP-STOP-Allel wird in vitro durch die HTNC rekombiniert..............................................72
4.2.3 Die Behandlung mit HTNC beeinflusst das Spreiten und die Proliferation von Fibroblasten........74
4.3 Exzision der STOP-Kassette in vivo....................................................................................................75
4.3.1 Bestätigung der Fibroblasten-spezifischen Expression der Cre-Rekombinase.............................76
4.3.2 Primäre Fibroblasten der COMP-PA-Linie sezernieren COMP in vitro.........................................77
4.3.3 COMP ist in der Haut von COMP-PA-Tieren detektierbar...........................................................79
5. Auswirkungen der forcierten Expression von COMP in der Dermis......................................................80
5.1 Eine dermale Überexpression von COMP resultiert in einer abnormalen Morphologie der Dermis... 80
5.2 Die forcierte Expression von COMP führt zu supramolekularen Veränderungen der dermalen EZM.. 81
5.3 Die forcierte Expression von COMP beeinflusst die mRNA-Level für einige EZM-Komponenten.........83
5.4 Die forcierte Expression von COMP beeinflusst die fibrotische Reaktion auf Bleomycin.....................85
IV Diskussion........................................................................................................................87
1. Die Einlagerung von COMP in die dermale EZM.................................................................................87
1.1 COMP ist während der Haarmorphogenese ein physiologischer Bestandteil der murinen Dermis......87
1.2 COMP ist ein Bestandteil der fibrotisch veränderten Dermis............................................................88
2. Mechanismen zur Regulation der COMP-Expression...........................................................................89
2.1 Die Zytokin-vermittelte Induktion.....................................................................................................89
2.2 Die mechanosensitive Regulation.....................................................................................................89
3. Analyse einer COMP-defizienten Mauslinie........................................................................................90
4. Analyse einer Mauslinie mit forcierter Expression von COMP.............................................................93
4.1 Die Generierung einer Maus mit forcierter Expression von COMP in der Dermis...............................93
4.2 Die konstitutive Überexpression von COMP verändert die supramolekulare Struktur der Dermis......96
5. Die Rolle von COMP in der Haut.........................................................................................................97
6. Konzept.............................................................................................................................................98
V Literatur............................................................................................................................99
VI Anhang..........................................................................................................................106
1. Sequenzierung der COMP-cDNA im Vektor KV622............................................................................106
2. Vollständige Nukleotidsequenz des Targetingvektors KV662.............................................................107
3. PCR-Screening der genomischen ES-Zell-DNA auf homologe Integration...........................................111
Teilpublikationen...............................................................................................................113
Danksagung.......................................................................................................................114
Erklärung...........................................................................................................................115
Lebenslauf..........................................................................................................................ns
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