Riboswitche für die konditionale Genexpression in Bakterien und Plastiden:
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| Sprache: | German |
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2013
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
ERKLAERUNG 2
INHALTSVERZEICHNIS 3
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 9
TABELLENVERZEICHNIS 11
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 12
1 EINLEITUNG 13
1.1 BIOLOGIE DER PIASTIDEN 13
1.1.1 GENOM VON PIASTIDEN - PIASTOM 14
1.1.2 GENEXPRESSION UND IHRE REGULATION IN PIASTIDEN 14
1.1.2.1 TRANSKRIPTION 15
1.1.2.2 POST-TRANSKRIPTIONALE PROZESSIERUNGEN UND STABILITAET DER MRNA 15
1.1.2.3 TRANSLATION 17
1.1.2.4 POST-TRANSLATIONALE MODIFIKATIONEN VON PROTEINEN 19
1.1.3 PROTEOM VON PIASTIDEN 19
1.2 GRUENE BIOTECHNOLOGIE 20
1.2.1 PIASTIDENTRANSFORMATION 20
1.2.1.1 ANWENDUNGEN IN DER WISSENSCHAFT 22
1.2.1.2 ANWENDUNGEN IN DER LANDWIRTSCHAFT 22
1.2.1.3 MOLEKULARES PHARMING 23
1.3 WISSENSCHAFTLICHER KENNTNISSTAND 24
1.3.1 VERFAHREN FUER DIE INDUZIERBARE GENEXPRESSION IN PIASTIDEN 24
1.3.2 RIBOSWITCHE 26
1.3.2.1 NATUERLICHE RIBOSWITCHE IN BAKTERIEN, PFLANZEN, ALGEN UND PILZEN
26
1.3.2.2 SYNTHETISCHE RIBOSWITCHE UND APTAMERE 28
1.3.2.3 ANWENDUNGEN SYNTHETISCHER RIBOSWITCHE 30
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INHALTSVERZEICHNIS 4
1.3.3 TRANSLATIONSABHAENGIGE MRNA-QUALITAETSKONTROLLMECHANISMEN IN
BAKTERIEN UND
EUKARYONTEN 32
1.4 PROBLEMSTELLUNG UND ZIELSETZUNG 34
1.4.1 ENTWICKLUNG EINES RIBOSWITCH-BASIERENDEN SYSTEMS FUER DIE
INDUZIERBARE
GENEXPRESSION IN PIASTIDEN 34
1.4.2 EXPERIMENTELLE UNTERSUCHUNGEN ZU MOEGLICHEN TRANSLATIONSABHAENGIGEN
MRNA-
QUALITAETSKONTROLLMECHANISMEN IN PIASTIDEN 34
2 MATERIALIEN UND METHODEN 35
2.1 MATERIALIEN 35
2.1.1 CHEMIKALIEN 35
2.1.2 PUFFER UND LOESUNGEN 35
2.1.2.1 DNA-PROBEN- UND LAUFPUFFER 35
2.1.2.2 RNA-PROBEN- UND LAUFPUFFER 35
2.1.2.3 DNA-PRAEPARATION AUS E. COLI 36
2.1.2.4 RNA-PRAEPARATION AUS E. COLI 36
2.1.2.5 DNA-PRAEPARATION AUS N. TABACUM 36
2.1.2.6 RNA-PRAEPARATION AUS N. TABACUM 36
2.1.2.7 SOUTHERN BLOT 36
2.1.2.8 NUKLEINSAEURE-HYBRIDISIERUNG 37
2.1.2.9 PROTEINISOLATION AUS E. COLI 37
2.1.2.10 PROTEINISOLATION AUS N. TABACUM 37
2.1.2.11 SDS-PAGE 38
2.1.2.12 COOMASSIE-FAERBUNG 38
2.1.2.13 WESTERN BLOT 38
2.1.3 NUKLEINSAEUREN 39
2.1.3.1 DNA-SYNTHESE 39
2.1.3.2 VEKTOREN 39
2.1.3.3 SONDEN 39
2.1.3.4 OLIGONUKLEOTIDE 40
2.1.3.5 GROESSENMARKER FUER NUKLEINSAEUREN 40
INHALTSVERZEICHNIS 5
2.1.4 PROTEINE 40
2.1.4.1 ENZYME 40
2.1.4.2 REKOMBINANTE PROTEINE 40
2.1.4.3 ANTIKOERPER 41
2.1.4.4 GROESSENMARKER FUER PROTEINE 41
2.1.5 ORGANISMEN 41
2.1.5.1 BAKTERIEN 41
2.1.5.2 PFLANZEN 41
2.1.6 MEDIEN 41
2.1.6.1 MEDIEN FUER E. COLI 41
2.1.6.2 MEDIEN FUER N. TABACUM 42
2.1.7 ANTIBIOTIKA 42
2.1.8 VERBRAUCHMATERIALIEN 43
2.1.9 REAKTIONSKITS 43
2.1.10 GERAETE 43
2.1.11 ONLINE-DATENBANKEN UND SOFTWARE 44
2.2 METHODEN 45
2.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 45
2.2.1.1 PLASMID-PRAEPARATION AUS E. COLI 45
2.2.1.2 DNA-PRAEPARATION AUS N. TABACUM 45
2.2.1.3 ELUTION VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 45
2.2.1.4 RNA-PRAEPARATION AUS E. COLI 45
2.2.1.5 RNA-PRAEPARATION AUS N. TABACUM 46
2.2.1.6 RESTRIKTIONSVERDAU 46
2.2.1.7 DEPHOSPHORYLIERUNG VON 5 -ENDEN 46
2.2.1.8 LIGATION VON NUKLEINSAEURE-FRAGMENTEN 47
2.2.1.9 BESTIMMUNG DER NUKLEINSAEUREKONZENTRATION 47
2.2.1.10 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA 47
2.2.1.11 DENATURIERENDE GELELEKTROPHORESE VON RNA 47
2.2.1.12 PCR 47
INHALTSVERZEICHNIS 6
2.2.1.13 DNA-SEQUENZIERUNG 47
2.2.1.14 SOUTHERN BLOT 48
2.2.1.15 SLOT BLOT 49
2.2.1.16 NORTHERN BLOT 49
2.2.2 BIOCHEMISCHE METHODEN 49
2.2.2.1 ISOLATION LOESLICHER PROTEINE AUS E. COLI 49
2.2.2.2 ISOLATION LOESLICHER PROTEINE AUS N. TABACUM 49
2.2.2.3 WESTERN BLOT 50
2.2.3 ANZUCHT VON E. COLI UND N. TABACUM 50
2.2.3.1 ANZUCHT VON E. COLI 50
2.2.3.2 ANZUCHT VON N. TABACUM 51
2.2.4 METHODEN DER TRANSFORMATION 51
2.2.4.1 TRANSFORMATION VON E. COLI 51
2.2.4.2 PIASTIDENTRANSFORMATION VON N. TABACUM 52
3 ERGEBNISSE 53
3.1 PLANUNG DER EXPERIMENTE UND KLONIERUNGEN 53
3.1.1 KONSTRUKTION DER RIBOSWITCH-EXPRESSIONSKASSETTEN 53
3.1.1.1 NATUERLICHE RIBOSWITCHE 53
3.1.1.2 MODIFIZIERTE UND SYNTHETISCHE RIBOSWITCHE 55
3.1.1.3 KLONIERUNG DER VEKTOREN FUER DIE PIASTIDENTRANSFORMATION 57
3.1.2 EINFUEHRUNG DER PUTATIVEN NMD-, NSD- UND NGD-MUTATIONEN IN
DASPETA-GEN... 60
3.1.2.1 PUTATIVE NMD-, NSD- UND NGD-MUTANTEN DES PETA-GENS 60
3.1.2.2 KLONIERUNG DER VEKTOREN FUER DIE PIASTIDENTRANSFORMATION 61
3.2 EXPERIMENTELLE DURCHFUEHRUNG UND AUSWERTUNG 62
3.2.1 RIBOSWITCHE ALS REGULATOREN DER GENEXPRESSION 62
3.2.1.1 ANALYSE DER RIBOSWITCH-FUNKTION IN E. COLI BEI WACHSTUM IN
M9-MEDIUM 62
3.2.1.2 ANALYSE DER RIBOSWITCH-FUNKTION IN E. COLI BEI WACHSTUM IN
LB-MEDIUM 66
3.2.1.3 INTEGRATION DER RIBOSWITCH-EXPRESSIONSKASSETTEN IN DAS PIASTOM
67
3.2.1.4 DER VARIEGIERTE PHAENOTYP 70
INHALTSVERZEICHNIS 7
3.2.1.5 ANALYSE DER RIBOSWITCH-FUNKTION IN N. TABACUM 72
3.2.2 EXPERIMENTELLE UNTERSUCHUNGEN ZU MOEGLICHEN NMD-, NSD- UND NMD-
MECHANISMEN IN PIASTIDEN 77
3.2.2.1 KONSTRUKTION DER PLASTIDENTRANSFORMATIONSVEKTOREN FUER DIE
EINFUEHRUNG DER
MUTIERTEN PETA-GENE IN DAS CHLOROPLASTENGENOM 77
3.2.2.2 INTEGRATION DES AA FA-SELEKTIONSMARKERS IN DAS PIASTOM VON N.
TABACUM 77
3.2.2.3 INTEGRATION DER PETA-MUTATIONEN IN DAS PIASTOM VON N. TABACUM 79
3.2.2.4 PHAENOTYPISCHE ANALYSE DER PETA-MUTANTEN 82
3.2.2.5 AKKUMULATION UND STABILITAET DER PERA-MRNA 83
4 DISKUSSION 85
4.1 ERWEITERUNG DES WISSENSCHAFTLICHEN KENNTNISSTANDES 85
4.1.1 RIBOSWITCHE FUER DIE KONDITIONALE GENEXPRESSION 85
4.1.1.1 NATUERLICHE UND MODIFIZIERTE RIBOSWITCHE IN BAKTERIEN 86
4.1.1.2 NATUERLICHE UND MODIFIZIERTE RIBOSWITCHE IN PIASTIDEN 88
4.1.1.3 DER SYNTHETISCHE THEOPHYLLIN-RIBOSWITCH FUER DIE INDUZIERBARE
GENEXPRESSION
IN BAKTERIEN UND PIASTIDEN 90
4.1.2 TRANSLATIONSABHAENGIGE MRNA-QUALITAETSKONTROLLMECHANISMEN 94
4.1.2.1 ABWESENHEIT VON NMD-, NSD- UND NGD-MECHANISMEN IN PIASTIDEN 94
4.2 AUSBLICK 97
4.2.1 RNA-TECHNOLOGIEN - DESIGNER-RIBOSWITCHE ALS FUNKTIONALE
KOMPONENTEN FUER DIE
SYNTHETISCHE BIOLOGIE UND MOLEKULARE BIOTECHNOLOGIE 97
4.2.1.1 ANWENDUNGEN SYNTHETISCHER RIBOSWITCHE IN PIASTIDEN 99
4.2.2 ABWESENHEIT VON TRANSLATIONSABHAENGIGEN
MRNA-QUALITAETSKONTROLLMECHANISMEN IN
PIASTIDEN 102
WISSENSCHAFTLICHE ZUSAMMENFASSUNG 103
SCIENTIFIC ABSTRACT 104
ALLGEMEINVERSTAENDLICHE ZUSAMMENFASSUNG 105
LITERATURVERZEICHNIS 106
INHALTSVERZEICHNIS 8
ANHANG A: PERSOENLICHE LISTE DER OLIGONUKLEOTIDE 125
ANHANG B: PERSOENLICHE LISTE DER PLASMIDE 127
ANHANG C: PERSOENLICHE LISTE DER PFLANZEN-LINIEN 132
ANHANG D: TABELLARISCHER LEBENSLAUF 133
ANHANG E: DOKTORANDENSEMINARE UND LEHRERFAHRUNG 135
E. 1 DOKTORANDENSEMINARE AM MAX-PLANCK-INSTITUT FUER MOLEKULARE
PFLANZENPHYSIOLOGIE 135
E.2 LEHRERFAHRUNG AN DER UNIVERSITAET POTSDAM 135
ANHANG F: LISTE DER VEROEFFENTLICHUNGEN 136
F.L PUBLIKATIONEN - PEER-REVIEWED 136
F.2 PRESSEAUSSENDUNG 136
F.3 VORTRAG UND POSTERPRAESENTATION 136
ANHANG G: EVALUATIONS BY FACULTY OF 1000: EXCEPTIONAL (OVERALL RATING
12) 137
G.L INDUCIBLE GENE EXPRESSION FROM THE PLASTID GENOME BY A SYNTHETIC
RIBOSWITCH 137
G.2 EVALUATIONS 137
ANHANG H: DANKSAGUNG 138
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