Genomweite Analyse des nukleozytoplasmatischen Transports herpesviraler Proteine:
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München
2011
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| adam_text | AUS DEM MAX VON PETTENKOFER-INSTITUT
FUER HYGIENE UND MEDIZINISCHE MIKROBIOLOGIE
DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN
VORSTAND: PROF. DR. MED. DR. H.C. ULRICH KOSZINOWSKI
GENOMWEITE ANALYSE DES NUKLEO-
ZYTOPLASMATISCHEN TRANSPORTS HERPESVIRALER
PROTEINE
DISSERTATION
ZUM ERWERB DES
DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN
AN DER MEDIZINISCHEN FAKULTAET
DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN
VORGELEGT VON
VERENA RASCHBICHLER
GEBOREN AM 26. JANUAR 1981 IN MUENCHEN
-2011-
HTTP://D-NB.INFO/1081952016
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
A. ABKUERZUNGSVERZEICHNNIS I
B. ABBILDUNGSVERZEICHNIS V
C. TABELLENVERZEICHNIS VII
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
1.1 GENOMWEITE ANALYSE DES NUKLEO-ZYTOPLASMATISCHEN
TRANSPORTS HERPESVIRALER PROTEINE 1
1.2 GENOME-WIDE ANALYSIS OF NUCIEO-CYTOPLASMIC TRANSPORT OF
HERPESVIRAL PROTEINS 2
2 EINLEITUNG 5
2.1 HERPESVIREN 5
2.1.1 DAS HERPES SIMPLEX VIRUS-1 (HSV-1) 6
2.1.1.1 PARTIKELAUFBAU, GENOM UND PROTEOM
VON HSV-1 6
2.1.1.2 DER REPLIKATIONSZYKLUS VON HSV-1 14
2.1.1.3 DIE NUKLEAERE AUSWANDERUNG VON HSV-1-CAPSIDEN 16
2.1.1.4 DER NUKLEO-ZYTOPLASMATISCHE TRANSPORT HERPESVIRALER PROTEINE....
19
2.2 NUKIEO-ZYTOPLASMATISCHER TRANSPORT 19
2.2.1 KEMLOKALISATIONSSEQUENZEN 23
2.2.2 KEMEXPORTSEQUENZEN 24
2.2.3 STRUKTURELLE EIGENSCHAFTEN DER TRANSPORTREZEPTOREN 25
2.2.4 DER KLASSISCHE
KEMIMPORT 27
2.2.5 DER IMPORTIN SS-VERMITTELTE KERNEXPORT 29
2.2.6 UNKONVENTIONELLE FUNKTIONEN DER IMPORTIN A/SS-FAMILIE UND
RAN 30
2.3 ZIELSETZUNG... 31
3 MATERIAL UND
METHODEN 32
3.1 MATERIAL 32
3.1.1 LABORGERAETE UND SOFTWARE 32
3.1.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN UND KITS 33
3.1.3 CHEMIKALIEN 34
3.1.4 ENZYME UND MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS 36
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.5 ANTIKOERPER UND SEREN 37
3.1.6 OLIGONUKLEOTIDE 38
3.1.7 PLASMIDE 42
3.2 ORGANISMEN 55
3.3 METHODEN 56
3.3.1 BAKTERIENKULTUR (E. COLI) 56
3.3.1.1 KULTIVIERUNG UND NAEHRMEDIEN 56
3.3.1.2 HERSTELLUNG CHEMISCH KOMPETENTER BAKTERIEN 56
3.3.1.3 TRANSFORMATION CHEMISCH KOMPETENTER BAKTERIEN 57
3.3.2 HEFEKULTUR (SACCHAROMYCES CEREVISIAE) 57
3.3.2.1 KULTIVIERUNG UND NAEHRMEDIEN 57
3.3.2.2 HERSTELLUNG CHEMISCH KOMPETENTER HEFEZELLEN 58
3.3.2.3 TRANSFORMATION CHEMISCH KOMPETENTER HEFEZELLEN 58
3.3.3 GEWEBEKULTUR VON SAEUGERZELLEN 59
3.3.3.1 KULTIVIERUNG UND KONSERVIERUNG 59
3.3.3.2 DNA-TRANSFEKTION 59
3.3.3.3 GEN-SILENCING MITTELS RNA-INTERFERENZ 59
3.3.3.3.1 SIRNA-DESIGN UND-TRANSFEKTION 59
3.3.3.3.2 HERSTELLUNG DER
LYSATE ZUR SIFENCMG-KONTROLLE 60
3.3.4 VIROLOGISCHE METHODEN 60
3.3.4.1 VERMEHRUNG DES VIRUSSTAMMS 60
3.3.4.2 HSV-1
-INFEKTION VON SAEUGERZELLEN 61
3.3.4.3 PLAQUE-ASSAY ZUR BESTIMMUNG DES VIRUSTITERS 61
3.3.4.4 KINETIK DER VIRUSREPLIKATION 62
3.3.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 62
3.3.5.1 PLASMID-DNA-MINI-PRAEPARATION AUS E. COLI 62
3.3.5.2 BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION 62
3.3.5.3 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 62
3.3.5.4 HORIZONTALE AGAROSE-GELELEKTOPHORESE 63
3.3.5.5 DNA-ISOLIERUNG AUS AGAROSEGELEN 63
3.3.5.6 KLONIERUNG MIT HILFE SEQUENZSPEZIFISCHER REKOMBINATION
(GATEWAY-KLONIERUNG) 63
3.3.5.7 DNA-RESTRIKTIONSVERDAU 64
3.3.5.8 DNA-UGATION 64
3.3.5.9 SEQUENZIERUNG VON DNA 65
3.3.5.10 ZIELGERICHTETE MUTAGENESE 65
3.3.6 BIOCHEMISCHE METHODEN 65
3.3.6.1 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 65
3.3.6.2 WESTERN BLOT 66
3.3.6.3 REKOMBINANTE PROTEINEXPRESSION UND AUFREINIGUNG VON
FUSIONSPROTEINEN AUS E. COLI 67
3.3.6.3.1 EXPRESSION 67
3.3.6.3.2 AUFREINIGUNG 67
3.3.7 METHODEN ZUR UNTERSUCHUNG VON PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN 68
3.3.7.1 HEFE-2-HYBRIDSYSTEM 68
3.3.7.1.1 DURCHFUEHRUNG DES HEFE-2-HYBRIDSYSTEMS 69
3.3.7.1.2 HEFE-2-HYBRIDSYSTEM IM HOCHDURCHSATZ: Y2H
DIRECT MATING
70
3.3.7.2 LUMIER-ASSAY 71
3.3.7.3 PUILDOWN-ASSAY 73
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.8 METHODEN ZUR IDENTIFIKATION VON PROTEINEN MIT NUKLEAERER
EXPORT-
AKTIVITAET 73
3.3.8.1 RAPAMYCIN-INDUZIERBARER NUKLEAERER EXPORMSSAY 73
3.3.8.2 INTERSPEZIES HETEROKARYON ASSAY 74
3.3.9 INDIREKTE IMMUNOFLUORESZENZ (IF) 75
ERGEBNISSE 7G
4.1 INTERAKTIONEN ZWISCHEN HUMANEN TRANSPORTFAKTOREN UND
DEM PROTEOM VON HSV-1
4.1.1 YEAST-2-HYBRID (Y2H)-ANALYSEN 76
4.1.2 DIE SUBZELLULAERE LOKALISATION HERPESVIRALER PROTEINE 81
4.1.3 VERGLEICHENDE ANALYSE DER IDENTIFIZIERTEN HSV-1-LNTERAKTOREN 83
4.1.4 VALIDIERUNG DER Y2H-LNTERAKTIONEN MITTELS LUMIER-ASSAY 85
4.2 DIE BEDEUTUNG VON CSELL FUER DIE HSV-1-REPLIKATION 37
4.3 DIE IDENTIFIZIERUNG NUKLEARER LOKALISATIONSSIGNALE 89
4.3.1 DIE VORHERGESAGTE NLS VON UL34
INTERAGIERT DIREKT MIT IMPORTIN A- GG
TRANSPORTFAKTOREN
4.3.2 DIE NLS DES UL34 VERMITTELT DEN NUKLEAEREN IMPORT VON
92
ZYTOPLASMATISCH-LOKALISIERTEM EYFP
4.3.3 DIE NUKLEAERE LOKALISATION VON UL34
IST UNABHAENGIG VON DESSEN
VORHERGESAGTER NLS
4.3.4 DIE VORHERGESAGTE NLS VON UL31
INTERAGIERT DIREKT MIT IMPORTIN A- GG
T RANSPORTFAKTOREN
4.3.5 DIE NLS DES UL31 VERMITTELT DEN NUKLEAEREN IMPORT VON PANZELLULAER-
QR
LOKALISIERTEM EYFP
4.3.6 DIE NUKLEAERE LOKALISATION VON UL31 IST ABHAENGIG VON DESSEN ^
VORHERGESAGTER NLS
4.3.7 DIE INTERAKTION ZWISCHEN UL31 UND UL34 IST
DURCH DIE UL31-MUTATION
NICHT BEEINTRAECHTIGT
4.3.8 DIE NLS VON UL31 IST FUER DIE KORREKTE LOKALISATION VON UL34
ERFORDERLICH
93
98
99
4.4 ERMITTLUNG DER NUKLEAEREN EXPORT-AKTIVITAET VON HSV-1- ...
PROTEINEN
4.4.1 DER RAPAMYCIN-INDUZIERBARE NUKLEAERE EXPORT-ASSAY 101
4.4.2 DAS VEKTOR-SYSTEM FUER DIE HOCHDURCHSATZ-ANALYSE DES
NUKLEAEREN
PROTEIN-EXPORTS 103
4.4.3 DER RAPAMYCIN-INDUZIERBARE NUKLEAERE EXPORT-ASSAY AM BEISPIEL VON
UL4 104
4.4.4 DER INTERSPEZIES-HETEROKARYON-ASSAY AM BEISPIEL VON
UL4 108
4.4.5 DER EXPORT-ASSAY AUF
HSV-1
-PROTEOM-EBENE 110
DISKUSSION 122
5.1 DIE IDENTIFIZIERUNG VON INTERAKTIONEN ZWISCHEN HUMANEN
TRANSPORTFAKTOREN UND HSV-1-PROTEINEN MITTELS Y2H UND 122
LUMIER :
INHALTSVERZEICHNIS
5.1.1 KRITISCHE BETRACHTUNG DES HEFE-2-HYBRID (Y2H)-SYSTEMS 122
5.1.2 VERIFIZIERUNGSMOEGLICHKEITEN 125
5.1.3 PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN ZWISCHEN ZELLULAEREN
TRANSPORTFAKTOREN
UND HSV-1-PROTEINEN
5.2 DIE ROLLE VON CSE1 L FUER DIE HSV-1-REPLIKATION 128
5.3 DER TRANSPORT VON UL34 AN DIE INNERE KERNMEMBRAN 130
5.4 DER NLS-VERMITTELTE NUKLEARE IMPORT VON UL31 131
5.5 VP22 ALS POTENTIELLES IMPORT-UND EXPORT-SUBSTRAT
134
5.6 DER NUKLEARE KERNEXPORT 135
5.6.1 METHODEN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON PROTEINEN MIT NUKLEARER EXPORT-
AKTIVITAET
5.6.2 HSV-1
-PROTEINE MIT NUKLEAERER EXPORT-AKTIVITAET 137
5.7 AUSBLICK 140
6 LITERATURVERZEICHNIS 141
7 LEBENSLAUF 162
8 PUBLIKATIONEN UND KONGRESSBEITRAEGE 163
9 DANKSAGUNG 165
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