Antileishmanielle Aktivität und zytotoxisches Potential von Resveratrol:
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INHALTSVERZEICHNIS
DANKSAGUNG III
INHALTSVERZEICHNIS IV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS IX
TABELLENVERZEICHNIS XI
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS XII
1. EINLEITUNG 14
1.1 RESVERATROL - EIN UEBERBLICK 14
1.2 RESVERATROL ALS NAHRUNGSERGAENZUNGSMITTEL 15
1.3 RESVERATROL IN DER MEDIZIN 16
1.4 RESVERATROL ALS ANTILEISHMANIELLES AGENS 20
1.4.1 DIE LEISHMANIOSE - VERBREITUNG UND UEBERTRAGUNGSWEGE 20
1.4.2 PATHOLOGIE UND KONTROLLE DER LEISHMANIEN-INFEKTION 23
1.4.3 THERAPEUTISCHE ANSAETZE 25
1.5 ZELLINDUZIERTE ABWEHRMECHANISMEN GEGENUEBER LEISHMANIEN 26
1.5.1 NO ALS MIKROBIZIDES EFFEKTORMOLEKUEL BEI INFEKTIONEN 26
1.5.2 ROS IN DER ZELLULAEREN IMMUNANTWORT 28
1.5.3 ROS UND RNS IN DER LEISHMANIENABWEHR 32
1.5.4 EINFLUSS VON RESVERATROL AUF DIE ZELLINDUZIERTE IMMUNABWEHR 32
1.5.5 EINFLUSS VON RESVERATROL AUF ROS UND APOPTOSE 33
1.5.6 ROLLE DER APOPTOSE IN IMMUNABWEHR UND HOMOEOSTASE 34
1.6 RESVERATROL IM KREBSGESCHEHEN 34
1.6.1 APOPTOSE 35
1.6.2 ABGRENZUNG ZWISCHEN APOPTOSE UND NEKROSE 36
1.6.3 EXTRINSISCHE UND INTRINSISCHE SIGNALKASKADE DER APOPTOSE 37
1.6.4 RESVERATROL UND APOPTOSE 39
1.7 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 40
2. MATERIAL UND METHODEN 42
2.1 GERAETE 42
2.2 CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 44
2.3 TEST- UND REFERENZSUBSTANZEN 46
IV
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INHALTSVERZEICHNIS
2.4 MATERIALIEN IN DER ZELLKULTUR 47
2.5 VERSUCHSTIERE, EUKARYOTISCHE ZELLEN UND PARASITEN 47
2.5.1 C57BL/6 WILDTYP-MAEUSE 47
2.5.2 J774-G8-MAKROPHAGEN ZELLLINIE 48
2.5.3 L929(CSF)-ZELLEN 48
2.5.4 A549-ZELLEN 48
2.5.5 CACO-2-ZELLEN 48
2.5.6 BMMO-MAKROPHAGEN AUS MURINEM KNOCHENMARK 49
2.5.7 LEISHMANIEN 49
2.6 KULTURMEDIEN 51
2.7 WASSER UND PUFFER 53
2.8 LOESUNGEN 54
2.9 STABILITAETSUNTERSUCHUNGEN 57
2.9.1 HPLC-UNTERSUCHUNGEN 57
2.9.2 MASSENSPEKTROMETRISCHE UNTERSUCHUNGEN VON RESVERATROL 57
2.10 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN IN FLUESSIGEM STICKSTOFF 58
2.11 AUFTAUEN VON ZELLEN AUS FLUESSIGEM STICKSTOFF 58
2.12 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL MITTELS NEUBAUER-ZAEHLKAMMER 59
2.13 MAKROPHAGEN-INFEKTION MIT
LEISHMANIA MAJOR-GVF
60
2.14 ZYTOTOXIZITAETS-ASSAYS 61
2.14.1 MTT-ASSAY 61
2.14.2 KRISTALLVIOLETT-ASSAY 61
2.15 DURCHFLUSSZYTOMETRIE (FACS) 62
2.15.1 LEBEND-TOT-DISKRIMINIERUNG VON MAKROPHAGEN 63
2.15.2 LEBEND-TOT-DISKRIMINIERUNG VON
LEISHMANIA MAJOR-GW
63
2.15.3 NACHWEIS VON
LEISHMANIA MAJOR-
GFP IN INFIZIERTEN MAKROPHAGEN 64
2.16 BESTIMMUNG DER NITRITKONZENTRATION (GRIESS ASSAY) 65
2.16.1 NO-MODULATION DURCH RESVERATROL 65
2.16.2 KINETIK DER NO-FREISETZUNG IN CACO-2-ZELLEN 66
2.17 ANTIOXIDATIVE AKTIVITAET VON RESVERATROL IM ZELLFREIEN VERSUCH 66
2.17.1 DPPH-ASSAY 66
2.17.2 SNP-ASSAY 67
V
INHALTSVERZEICHNIS
2.18 CASPASE 3- UND CASPASE 8-ENZYMAKTIVITAET IN A549-ZELLEN 67
2.19 HISTOLOGISCHE UND ZYTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 68
2.19.1 FIXIERUNG VON ZELLEN MIT PARAFORMALDEHYD (PFA) 68
2.19.2 HERSTELLUNG VON ZYTOSPINPRAEPARATEN AUS ZELLSUSPENSIONEN 68
2.19.3 HERSTELLUNG VON DECKGLAESCHENPRAEPARATEN 69
2.19.4 ANFAERBUNG VON DECKGLAESCHENPRAEPARATEN 69
2.20 MIKROSKOPIE UND FOTOGRAPHISCHE DOKUMENTATION VON ZELLPRAEPARATEN
....71
2.21 BESTIMMUNG REAKTIVER SAUERSTOFFSPEZIES 72
2.21.1 MIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG ZUR ROS-BILDUNG 72
2.21.2 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNG ZUR ROS-BILDUNG 72
2.22 BLOCKADE DER ATMUNGSKETTE AM KOMPLEX I IM MITOCHONDRIUM 73
2.23 WESTERN BLOT-ANALYSE 74
2.23.1 BESTIMMUNG DER GESAMTPROTEINMENGE MITTELS BCA-METHODE 74
2.23.2 ZELLLYSAT-HERSTELLUNG FUER INOS-EXPRESSION 75
2.23.3 ZELLLYSAT-HERSTELLUNG FUER CASPASE 3-EXPRESSION 75
2.23.4 PROBENVORBEREITUNG FUER GELEKTROPHORESE 76
2.23.5 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 76
2.23.6 NACHWEIS FIXIERTER PROTEINE AUF NITROCELLULOSE-MEMBRANEN 77
2.23.7 ABLOESEN VON ANTIKOERPERN VON NITROCELLULOSE-MEMBRANEN 78
2.24 NACHWEIS VON MYCOPLASMA-KONTAMINATION IN ZELLLINIEN 79
2.25 STATISTIK 80
3. ERGEBNISSE 81
3.1 STABILITAET VON
TRANS-
RESVERATROL IN LOESUNG 81
3.1.1 VERFAERBUNG VON RESVERATROL IN LOESUNG NACH UV-LICHT-BESTRAHLUNG..
81
3.1.2 HPLC-UNTERSUCHUNG VON IRANS-RESVERATROL-STOCKLOESUNGEN 82
3.1.3 STRUKTURANALYSE DER BESTRAHLTEN RESVERATROL-LOESUNGEN 86
3.2 LEISHMANIEN UND INFEKTION VON MAKROPHAGEN 88
3.2.1
IN
U/FRO-STUDIEN ZUR ANTILEISHMANIELLEN AKTIVITAET VON RESVERATROL 89
3.2.2 TRANSFEKTION UND MORPHOLOGIE VON
LEISHMANIA MAJOR-
PARASITEN 90
3.3 ANTILEIHMANIELLES POTENTIAL VON RESVERATROL 92
3.3.1 AUFBAU UND PRINZIP DER DURCHFLUSSZYTOMETRIE 92
3.3.2 FACS-ANALYSE PROMASTIGOTER
LEISHMANIA MAJOR-
GFP 93
3.3.3 FACS-ANALYSE INFIZIERTER BMMO 94
VI
INHALTSVERZEICHNIS
3.4 ZYTOTOXISCHES POTENTIAL VON RESVERATROL BEI BMMO 96
3.4.1 BESTIMMUNG DER ZELLVIABILITAET VIA MTT-ASSAY 96
3.4.2 BESTIMMUNG DER ZELLVIABILITAET VIA FACS-ASSAY 98
3.4.3 MIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG DER ZELLVIABILITAET 99
3.5 ANTILEISHMANIELLES UND ZYTOTOXISCHES
POTENTIAL VON RESVERATROL BEI
J774-G8....
101
3.5.1 BESTIMMUNG DER ZELLVIABILITAET VIA MTT-ASSAY 101
3.5.2 FACS-BESTIMMUNG INFIZIERTER UND NICHT-INFIZIERTER J774-G8 102
3.5.3 MIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG DER ZELLVIABILITAET 104
3.5.4 SELEKTIVITAETSINDEX (SI) 105
3.6 NACHWEIS DER NO-BILDUNG IN MAKROPHAGEN 105
3.6.1 NO-SCAVENGING-AKTIVITAET VON RESVERATROL IM ZELLFREIEN SYSTEM 106
3.6.2 NO-SCAVENGING-AKTIVITAET VON RESVERATROL IM ZELLBASIERTEN SYSTEM
107
3.6.3 NO-BILDUNG BEI VORINKUBATION MIT RESVERATROL 110
3.6.4 EINFLUSS VON RESVERATROL AUF DIE INOS-EXPRESSION 112
3.7 ZYTOTOXIZITAET VON RESVERATROL AUF FIBROBLASTENZELLLINIE L929(CSF)
113
3.8 ANTIOXIDATIVE EFFEKTE VON RESVERATROL: DPPH-ASSAY 115
3.8.1 PRINZIP DES DPPH-ASSAYS 116
3.8.2 DPPH-RADIKAL-SCAVENGING VON RESVERATROL 117
3.8.3 ERGEBNISSE DES DPPH-ASSAYS 118
3.9 ZYTOTOXISCHES UND PRO-APOPTOTISCHES POTENTIAL VON RESVERATROL 119
3.9.1 APOPTOSE-INDUKTION IN J774-G8-MAKROPHAGEN 119
3.10 FLUORESZENZBASIERTE UNTERSUCHUNGEN ZUR ROS-BILDUNG 123
3.10.1 PRINZIP DER ROS-FAERBUNG MIT H
2
-DCF-DA 123
3.10.2 ROS-BILDUNG IN J774-G8-MAKROPHAGEN 124
3.10.3 ROS-BILDUNG IN A549-ZELLEN 127
3.11 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNG ZUR ROS-BILDUNG 131
3.11.1 TITRATION DES FARBSTOFFS H
2
-DCF-DA IM FACS-GERAET BD* LSR II.... 131
3.11.2 ROS-BILDUNG IN A549-ZELLEN DURCH RESVERATROL 132
3.12 APOPTOSE-INDUKTION IN A549-ZELLEN 133
3.13 ZYTOTOXIZITAET VON RESVERATROL IN A549-ZELLEN (MTT-TEST) 137
3.14 CASPASE-INDUKTION IN A549-ZELLEN DURCH RESVERATROL 137
3.14.1 CASPASE 3-AKTIVIERUNG (KOLORIMETRIE) 137
3.14.2 CASPASE 8-AKTIVIERUNG (KOLORIMETRIE) 139
VII
INHALTSVERZEICHNIS
3.14.3 CASPASE 3-AKTIVIERUNG (WESTERN BLOT) 141
3.15 RESVERATROL IM INTRINSISCHEN APOPTOSE-SIGNALWEG 142
3.15.1 TOXIZITAET VON ROTENON AUF A549-ZELLEN UND J774-G8-MAKROPHAGEN....
144
3.15.2 RESVERATROL-INDUZIERTE ROS-BILDUNG IN GEGENWART VON ROTENON (I)
144
3.15.3 RESVERATROL-INDUZIERTE ROS-BILDUNG IN GEGENWART VON ROTENON (II)
...148
3.16 EXKURS: CACO-2-ZELLEN 152
3.16.1 NO-MODULATION IN CACO-2-ZELLEN DURCH RESVERATROL 152
3.16.2 NACHWEIS DER DIFFERENZIERUNG DER CACO-2-ZELLEN 154
4. DISKUSSION 156
4.1 RESVERATROL: KORRELATION VON AKTIVITAET UND ZYTOTOXISCHEM POTENTIAL
158
4.2 SICHERHEIT VON RESVERATROL 163
4.2.1 BIOVERFUEGBARKEIT VON RESVERATROL 165
4.3 NAHRUNGSERGAENZUNG MIT RESVERATROL 169
4.4 EINFLUSS VON RESVERATROL AUF NO- BZW. ROS-BILDUNG IN MAKROPHAGEN...
171
4.4.1 EINFLUSS AUF DIE INDUZIERBARE NO-SYNTHASE UND NO-PRODUKTION 171
4.4.2 EINFLUSS AUF DIE ROS-BILDUNG 174
4.5 EINFLUSS AUF DIE APOPTOSE-INDUKTION
IN VITRO
176
4.5.1 ROS-BILDUNG IN A549-ZELLEN NACH BLOCKADE DER ATMUNGSKETTE 178
4.5.2 ROS-BILDUNG IN MAKROPHAGEN NACH BLOCKADE DER ATMUNGSKETTE.... 179
4.6 RESVERATROL UND KREBS:
IN
U/UO-STUDIEN 181
4.7 RESVERATROL UND ANTI-AGING 181
4.8 FAZIT UND AUSBLICK 182
5. ZUSAMMENFASSUNG 184
6. SUMMARY 188
7. LITERATURVERZEICHNIS 191
8. PUBLIKATIONSVERZEICHNIS 212
9. ANHANG 213
10. SELBSTSTAENDIGKEITSERKLAERUNG 214
VIII
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