Untersuchungen zur funktionellen Rolle des Proteins WDR36 und seine Beteiligung bei der Pathogenese des Glaukoms:
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2012
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 DAS GLAUKOM 1
1.2 GLAUKOM-ASSOZIIERTE GENE 3
1.2.1 MYOCILIN (MYOC) 4
1.2.2 OPTINEURIN (OPTN) 4
1.2.3 NEUROTROPHIN 4 (NTF-4) 5
1.2.4 WD-REPEAT PROTEIN 36 (WDR36) 6
1.3 PROZESSIERUNG DER RIBOSOMALEN RNA (RRNA) 9
2 ZIELSETZUNG 12
3 MATERIAL UND METHODEN 13
3.1 MATERIALLISTEN 13
3.1.1 REAGENZIENLISTE 13
3.1.2 ENZYME 15
3.1.3 REAKTIONS-KITS 16
3.1.4 OLIGONUKLEOTIDPRIMER 16
3.1.5 PLASMIDE 19
3.1.6 BAKTERIEN 20
3.1.7 GROESSENSTANDARDS 20
3.1.8 GERAETE 20
3.1.9 VERBRAUCHSMATERIALIEN 22
3.1.10 ANTIKOERPER 23
3.1.11 REZEPTE FUER PUFFER UND GELE 23
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITSMETHODEN 27
3.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN 27
3.2.2 ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN UND PCR CLEAN-UP 28
3.2.3 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 28
3.2.4 CHEMISCHE TRANSFORMATION VON E. COLI 28
3.2.5 ENZYMATISCHER VERDAU VON PLASMID-DNA 29
I
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INHALTSVERZEICHNIS
3.2.6 LIGATION 29
3.2.7 KLONIERUNG VON UEBEREXPRESSIONSPLASMIDEN 29
3.2.7.1 KLONIERUNG DES PCDNA3.1-MYC-HIS-WDR36-VEKTORS 29
3.2.7.2 KLONIERUNG DES VEKTORS PGEX-4T-3-WDR36 30
3.2.8 DNA-SEQUENZANALYSE 30
3.2.9 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 30
3.2.10 RNA-ISOLIERUNG 31
3.2.11 HERSTELLUNG VON CDNA (COMPLEMENTAERE DNA) 31
3.2.12 DURCHFUEHRUNG DER QUANTITATIVEN REAL-TIME REVERSE
TRANSKRIPTION-PCR.
33
3.2.13 NORTHERN-BLOT 35
3.2.13.1 GENERIERUNG DER SONDEN 35
3.2.13.2 DURCHFUEHRUNG DER NORTHERN-BLOT ANALYSEN 36
3.2.14 DESIGN UND SYNTHESE DER VERWENDETEN SIRNAS 38
3.3 GENERIERUNG VON GENTECHNISCH MODIFIZIERTEN MURINEN EMBRYONALEN
STAMM
ZELLLINIEN ZU ETABLIERUNG EINER KONDITIONALEN IM/R36-DEFIZIENTEN MAUS 40
3.3.1 RECOMBINEERING 40
3.3.1.1 VERWENDETE PCR-PROGRAMME 41
3.3.1.2 INDUKTION DER EXPRESSION 42
3.3.1.3 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIEN UND ELEKTROPORATION 43
3.3.1.4 SELEKTION UND VERIFIZIERUNG DER INTEGRATION 43
3.3.2 ELEKTROPORATION DES LINEARISIERTEN VEKTORS IN MURINE EMBRYONALE
STAMMZELLEN 44
3.3.3 NACHWEIS GENETISCH MODIFIZIERTER EMBRYONALER STAMMZELLEN 44
3.3.3.1 LONG-RANGE-PCR 44
3.3.3.2 LACZ FAERBUNG 45
3.4 ZELLKULTUR 46
3.4.1 ALLGEMEINE ZELLKULTURTECHNIKEN 46
3.4.2 ZELLZAHLBESTIMMUNG 46
3.4.3 TRANSFEKTION VON ZELLEN 46
3.4.3.1 TRANSFEKTION VON VEKTOREN 46
3.4.3.2 TRANSFEKTION VON SIRNA 47
3.4.4 ZELLKULTURBASIERENDE VERSUCHE 47
3.4.4.1 PULSE-CHASE EXPERIMENT 47
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.4.2 BESTIMMUNG APOPTOTISCHER ZELLEN MIT DEM CELL DEATH DETECTION
ELISA 49
3.4.4.3 STATISTISCHE ANALYSE DES DNA GEHALTS MITTELS PROPIDIUMIODID-
FAERBUNG 50
3.4.4.4 IMMUNZYTOCHEMISCHE FAERBUNGEN 51
3.5 TIERE UND TIEREXPERIRRTENTELLES ARBEITEN 52
3.5.1 ALLGEMEINE TIERHALTUNGSBEDINGUNGEN 52
3.5.2 DNA ISOLIERUNG AUS MAUSSCHWAENZEN 52
3.5.3 VERWENDETE VERSUCHSTIERLINIEN UND DEREN GENOTYPISIERUNG 52
3.5.4 INTRAOKULAERE INJEKTIONEN 54
3.5.4.1 INTRAVITREALE INJEKTION VON NMDA 54
3.5.4.2 INDUKTION EINES EXPERIMENTELLEN GLAUKOMS DURCH INTRAKAMERALE
INJEKTION VON POLYSTYREN-MICROBEADS 55
3.5.5 BESTIMMUNG DES INTRAOKULAEREN DRUCKS 56
3.5.6 BESTIMMUNG DER GESAMTZAHL DER RETINALEN GANGLIENZELLEN 57
3.5.7 ISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG VON MAUS-ZYGOTEN 57
3.5.8 INJEKTION VON SIRNA IN MAUS-ZYGOTEN 59
3.6 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 60
3.6.1 CO-IMMUNOPRAEZIPITATION 60
3.6.2 BAKTERIELLE EXPRESSION VON GST-WDR36 UND VORBEREITUNG FUER
PULLDOWN-
ASSAYS 61
3.6.3 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 61
3.6.4 SEMIDRY BLOTTING 62
3.6.5 NACHWEIS SPEZIFISCHER PROTEINBANDEN 63
3.6.6 COOMASSIE-FAERBUNG 63
3.7 HISTOLOGISCHE METHODEN 64
3.7.1 EPONEINBETTUNG UND HERSTELLUNG VON SEMIDUENNSCHNITTEN 64
3.7.2 HISTOLOGISCHE FAERBUNGEN 64
3.7.2.1 RICHARDSON-FAERBUNG 64
3.7.2.2 PARAPHENYLENDIAMIN-FAERBUNG 65
3.8 LICHT- UND FLUORESZENZMIKROSKOPIE 65
3.9 AUSWERTUNG UND STATISTIK 65
III
INHALTSVERZEICHNIS
4 ERGEBNISSE 66
4.1 ANALYSE DES PHAENOTYPS VON HOMOZYGOTEN WDR36-DEFIZIENTEN MAEUSEN 66
4.2 PHAENOTYPISCHE ANALYSE DER MIKROINJEKTIONSVERSUCHE 69
4.3 SUBZELLULAERE LOKALISIERUNG VON WDR36 72
4.4 FUNKTION VON WDR36 AUF ZELLULAERER EBENE 75
4.4.1 EXPRESSIONSANALYSE 75
4.4.2 ETABLIERUNG EINES KNOCK-DOWN DER WDR36 EXPRESSION IN HTM-N ZELLEN
76
4.4.3 WACHSTUMSVERHALTEN DER HTM-N ZELLEN NACH WDR36 DEPLETION 77
4.4.4 UNTERSUCHUNG DER APOPTOSERATE NACH WDR36 DEPLETION 78
4.4.5 NORTHERN-BLOT ANALYSE ZUR BETEILIGUNG VON WDR36 AN DER 18S RRNA
PROZESSIERUNG 81
4.4.6 PULSE-CHASE ANALYSEN ZUR BETEILIGUNG VON WDR36 AN DER 18S RRNA
PROZESSIERUNG 83
4.4.7 UNTERSUCHUNG VON PWP2 ALS MOEGLICHEM INTERAKTIONSPARTNER VON
WDR36 86
4.4.8 UNTERSUCHUNG VON MOEGLICHEN INTERAKTIONSPARTNERN MITTELS GST-
PULLDOWN 87
4.5 HETEROZYGOT WDR36-DEFIZIENTE MAEUSE 88
4.5.1 PHAENOTYP DER HETEROZYGOTEN WDR36-DEFIZIENTEN MAEUSE 88
4.5.2 ANALYSE DER RRNA PROZESSIERUNG IM AUGE VON HETEROZYGOTEN WDR36-
DEFIZIENTEN MAEUSEN 89
4.5.3 UNTERSUCHUNG DER VULNERABILITAET RETINALER GANGLIENZELLEN IN
HETEROZYGOTEN WDR36-DEFIZIENTEN MAEUSEN 91
4.5.3.1 NMDA INDUZIERTE EXZITOTOXISCHE SCHAEDIGUNG VON RETINALEN
GANGLIEN
ZELLEN 92
4.5.3.2 INDUKTION EINES EXPERIMENTELLEN GLAUKOMS DURCH VORDERKAMMER
INJEKTION VON POLYSTYREN-MICROBEADS 94
4.5.3.3 INDUKTION EINES GLAUKOMS DURCH VERPAARUNG MIT SSB1-CTGF-MAEUSEN
98
4.6 UNTERSUCHUNGEN ZUR PCAGGS-WDR36_DEL605-607-MAUSLINIE 100
4.6.1 GENETIC RESCUE 100
4.6.2 PHAENOTYP DER HETEROZYGOTEN WOER36-DEFIZIENTEN DEL605-607 MAUS.. 102
IV
INHALTSVERZEICHNIS
4.6.2.1 NMDA INDUZIERTE EXZITOTOXISCHE SCHAEDIGUNG VON RETINALEN
GANGLIEN
ZELLEN DER HETEROZYGOTEN WDR36 DEFIZIENTEN_DEL605-607 MAUS 104
4.7 GENERIERUNG EINER KONDITIONELLEN WDR36-DEFIZIENTEN EMBRYONALEN
STAMM
ZELLLINIE 106
4.7.1 THEORETISCHE UEBERLEGUNGEN 106
4.7.2 GENERIERUNG DES ZIELVEKTORS 107
4.7.2.1 SUBKLONIEREN DES ZU MODIFIZIERENDEN GENOMISCHEN BEREICHS VON
WDR36 108
4.7.2.2 INSERTION EINES KANAMYCIN-RESISTENZGENS IN VEKTOR STEPL 110
4.7.2.3 REKOMBINATION DER LOXP-SITES IN VEKTOR STEP2 112
4.7.2.4 INSERTION EINES CHLORAMPHENICOL-RESISTENZGENS IN VEKTOR STEP3
..113
4.7.2.5 INSERTION EINER SS-GEO-KASSETTE IN VEKTOR STEP4A 115
4.7.3 NACHWEIS DER HOMOLOGEN REKOMBINATION IN ES-ZELLEN MITTELS LONG-
RANGE-PCR 118
4.7.4 NACHWEIS DER SS-GALAKTOSIDASE AKTIVITAET IN DEN GENTECHNISCH
MODIFIZIERTEN MURINEN ES-ZELLEN 120
5 DISKUSSION 121
5.1 WDR36 IST EIN ESSENTIELLES PROTEIN 121
5.2 DEPLETION VON WDR36 FUEHRT IN ZELLEN ZUR APOPTOSE 123
5.3 WDR36 ALS BONA FIDE KOMPONENTE DES SMALL-SUBUNIT PROZESSOMS 124
5.4 HETEROZYGOTE WDR36-DEFIZIENTE MAEUSE HABEN KEINE HOEHERE ANFAELLIGKEIT
FUER
GLAUKOMATOESE SCHAEDEN 127
5.5 UEBEREXPRESSION VON MUTIERTEM WDR36 FUEHRT ZU KEINER AENDERUNG DES
PHAENOTYPS WDR36-DEFIZIENTER MAEUSE 130
5.6 WDR36 UND DAS GLAUKOM 131
6 ZUSAMMENFASSUNG 133
7 ANHANG 135
7.1 LITERATURVERZEICHNIS 135
7.2 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 147
7.3 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 150
7.4 TABELLENVERZEICHNIS 153
V
INHALTSVERZEICHNIS
7.5 DANKSAGUNG 155
7.6 ERKLAERUNG 156
VI
|
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| spelling | Gallenberger, Martin Verfasser aut Untersuchungen zur funktionellen Rolle des Proteins WDR36 und seine Beteiligung bei der Pathogenese des Glaukoms von Martin Gallenberger 2012 VI, 134 Bl. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Regensburg, Univ., Diss., 2012 Weitwinkelglaukom (DE-588)4195210-8 gnd rswk-swf Pathogenese (DE-588)4115512-9 gnd rswk-swf Proteine (DE-588)4076388-2 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Weitwinkelglaukom (DE-588)4195210-8 s Pathogenese (DE-588)4115512-9 s Proteine (DE-588)4076388-2 s b DE-604 Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:355-epub-265830 http://epub.uni-regensburg.de/26583/ Verlag kostenfrei Volltext https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:355-epub-265830 Resolving-System DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=026842249&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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