Identifizierung und Regulation Nelfinavir-induzierter Peptidhormone:
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München
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität
2013
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INHALT
1 EINLEITUNG 1
1.1 DIE PEPTIDHORMONE ADM2 UND INHIBIN SSE 2
1.1.1 ADRENOMEDULLIN 2 (ADM2) 2
1.1.2 INHIBINE 4
1.2 DAS ENDOPLASMATISCHE RETIKULUM 5
1.3 ER STRESS 6
1.4 TRANSKRIPTIONSFAKTOREN DER ER STRESS ANTWORT 7
1.4.1 ATF4 7
1.4.2 ATF3 8
1.4.3 CHOP 9
1.4.4 XBP1 9
1.5 ER STRESS INDUKTOREN 10
1.5.1 NELFINAVIR 10
1.5.2 ANDERE STRESSINDUKTOREN 10
2 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 11
3 MATERIALIEN UND METHODEN 12
3.1 MATERIALIEN 12
3.1.1 GERAETE UND INSTRUMENTE 12
3.1.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 12
3.1.3 REAGENZIEN 13
3.1.3.1 ZELLKULTUR 13
3.1.3.2 REVERSE TRANSKRIPTASE PCR 14
3.1.3.3 REAL-TIME-PCR 15
3.1.3.4 IMMUNFLUORESZENZ 15
3.1.3.5 PLASMID-KLONIERUNG 15
3.2 METHODEN 16
3.2.1 ZELLKULTUR 16
3.2.2 RNA-EXTRAKTION 16
3.2.3 REVERSE-TRANSKRIPTASE-POLYMERASE KETTENREAKTION 17
3.2.3.1 UMSCHREIBUNG RNA IN CDNA 17
3.2.3.2 POLYMERASEKETTENREAKTION 17
III
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IMAGE 2
3.2.4 GELELEKTROPHORESE 20
3.2.5 REAL-TIME-PCR 21
3.2.6 MICROARRAY 24
3.2.7 IMMUNFLUORESZENZ 24
3.2.8 PLASMIDKLONIERUNG UND TRANSFEKTION 26
3.2.8.1 PCR KLONIERUNG 26
3.2.8.2 TRANSFEKTION 28
4 ERGEBNISSE 29
4.1 MICROARRAY ANALYSE NELFINAVIR REGULIERTER GENE 29
4.2 PCR ANALYSEN ZUR VALIDIERUNG DES MICROARRAYS 33
4.2.1 ADM2 HOCHREGULATION IN JURKAT-ZELLEN 33
4.2.2 ADM2 HOCHREGULATION IN EPITHELIALEN TUMOREN 35
4.3 ZEITABHAENGIGE PCR ANALYSEN DER ER STRESS REAKTION 36
4.3.1 MCF7-ZELLEN NACH NELFINAVIRBEHANDLUNG 36
4.3.2 MCF7-ZELLEN NACH BEHANDLUNG ANDERER ER STRESS INDUKTOREN 38
4.3.2.1 TUNICAMYZIN 38
4.3.2.2 THAPSIGARGIN 39
4.3.2.3 QUERCETIN 40
4.4 INHIBIN SSE HOCHREGULATION IM VERGLEICH MIT ANDEREN INHIBINEN 41
4.5 REAL-TIME-PCR ANALYSEN 42
4.5.1 - XBP1 SPLICING NACH QUERCETIN- UND TUNICAMYZINBEHANDLUNG 43
4.5.2 XBP1 SPLICING NACH NELFINAVIR-, QUERCETIN- UND
BORTEZOMIBBEHANDLUNG 45
4.6 NACHWEIS DER ADM2 HOCHREGULATION AUF PROTEINEBENE 46
4.6.1 IMMUNFLUORESZENZ VON HELA-ZELLEN NACH NELFINAVIRBEHANDLUNG 46
4.6.2 IMMUNFLUORESZENZ NACH BEHANDLUNG MIT ANDEREN ER STRESS INDUKTOREN
47
4.7 PCR KLONIERUNG VON ER STRESS REGULIERENDEN TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 48
4.7.1 ATF4 KLONIERUNG: NACHWEIS IN DER IMMUNFLUORESZENZ 49
4.7.2 ADM2: EIN ZIELGEN VON ATF4 50
5 DISKUSSION 52
5.1 DIE ROLLE VON ADM2 BEI DER NEOANGIOGENESE 52
5.2 DIE INDUKTION VON ADM2 DURCH ER STRESS 53
5.3 ADM2 IST EIN ZIELGEN VON ATF4 56
IV
IMAGE 3
5.4 ADM2 EXPRESSION IN TUMOREN 57
5.5 ANDERE ER STRESS MARKER 58
6 ZUSAMMENFASSUNG 60
7 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS VI
8 LITERATURVERZEICHNIS VIII
9 ANHANG XVII
9.1 DANKSAGUNG XVII
9.2 LEBENSLAUF XVIII
V
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