Der Einfluss von Sox9 auf Zellvitalität und Differenzierungspotential von adulten mesenchymalen Stammzellen:
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 DER TRANSKRIPTIONSFAKTOR SOX9 1
1.1.1 DIE ROLLE VON SOX9 WAEHREND DER CHONDROGENESE 4
1.1.2 DIE ROLLE VON SOX9 IN ADULTEM GEWEBE 8
1.1.3 DIE ROLLE VON SOX9 IN DER TUMORGENESE 9
1.1.4 EINE MUTATION VON SOX9 FUEHRT ZUR KAMPOMELEN DYSPLASIE 10
1.2 MESENCHYMALE STAMMZELLEN (MSC) 11
1.2.1 MSC AUS VERSCHIEDENEN GEWEBEQUELLEN - KNOCHENMARK VERSUS
FETTGEWEBE 11
1.2.2 DIFFERENZIERUNG VON MSC 12
1.2.3 SIGNALTRANSDUKTION IN MSC 14
1.2.4 ZELLZYKLUSREGULIERUNG IN MSC 17
1.3 TISSUE ENGINEERING AM BEISPIEL DER KNORPELREPARATUR 19
2 ZIEL DER ARBEIT 21
3 MATERIAL UND METHODEN 22
3.1 ZELLKULTUR 22
3.1.1 ISOLIERUNG VON MESENCHYMALEN STAMMZELLEN AUS KNOCHENMARK UND
FETTGEWEBE 22
3.1.2 DIFFERENZIERUNG 22
3.1.2.1 OSTEOGENESE 22
3.1.2.2 CHONDROGENESE 22
3.1.2.3 ADIPOGENESE 23
3.1.3 TRANSFEKTION VON ECOPACK2-293 ZELLEN UND GENERIERUNG VON
RETROVIRALEN PARTIKELN 23
3.1.4 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON MSC MIT SIRNA 24
3.1.5 TRANSDUKTION VON MSC MIT RETROVIREN 25
3.2 MOLEKULARBIOLOGIE 25
3.2.1 KLONIERUNG VERWENDETER PLASMIDE 25
3.2.1.1 ISOLIERUNG UND AUFREINIGUNG VON PLASMID DNA 26
3.2.1.2 RESTRIKTION MITTELS ENZYMEN 26
3.2.1.3 LIGATION 27
3.2.1.4 TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA IN ONE SHOT* TOPIO CHEMISCH
KOMPETENTE E.COLI ZELLEN. 27
3.2.1.5 AGAROSEGEL ELEKTROPHORESE 28
3.2.2 RNA ISOLIERUNG AUS MSC 28
3.2.2.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG, QUALITAETSPRUEFUNG UND CDNA SYNTHESE 29
3.2.2.2 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 29
3.2.2.3 PCR-BASIERTE MICROARRAY ANALYSE 31
V
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INHALTSVERZEICHNIS
3.3 PROTEINBIOCHEMIE 31
3.3.1 PROTEINISOLATION AUS MSC 31
3.3.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINLYSATEN 32
3.3.3 WESTERN BLOT ANALYSE 32
3.3.4 OSTEOCALCIN-EIA 33
3.3.5 BRDU-ASSAY .* 34
3.3.6 CASPASE ASSAY 34
3.3.7 ALKALISCHE PHOSPHATASE ASSAY 34
3.4 HISTOLOGIE UND IMMUNFLUORESZENZ 35
3.4.1 ALIZARINROT S FAERBUNG 35
3.4.2 OELROT 0 FAERBUNG 35
3.4.3 MORPHOMETRISCHE AUSWERTUNG 35
3.4.4 PARAFFINSCHNITTE 36
3.4.5 WEIGERT S HAEMATOXYLIN UND ALCIANBLAU FAERBUNG 36
3.4.6 IMMUNFLUORESZENZ 36
3.5 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNG 37
3.5.1 ZELLZYKLUS MESSUNG 37
3.5.2 MESSUNG VON OBERFLAECHENMARKERN 37
3.6 INHIBITIONSVERSUCHE 38
3.6.1 MEK1/2 INHIBITION MITTELS U0126 38
3.6.2 HEMMUNG DER TRANSKRIPTION MITTELS ACTINOMYCIN D 38
3.6.3 HEMMUNG DER PROTEINSYNTHESE MITTELS CYCLOHEXIMID 38
3.7 LUCIFERASE-REPORTER-ASSAY 39
3.8 STATISTISCHE AUSWERTUNG 39
4 ERGEBNISSE 40
4.1 VERGLEICH ZWISCHEN ASC UND BMSC 40
4.1.1 VERGLEICHENDE ANALYSE VON OBERFLAECHENMARKERN 40
4.1.2 VERGLEICHENDE GENEXPRESSIONSANALYSE 42
4.2 GENERIERUNG EINES SOX9 KNOCKDOWNS UND EINER SOX9 UEBEREXPRESSION IN
UNDIFFERENZIERTEN RMSC.... 43
4.3 EXPRESSION VERSCHIEDENER MARKERGENE IN RBMSC 45
4.4 EINE SOX9 REDUKTION ERHOEHT DIE OSTEOCALCINSEKRETION UEBER EINEN
UNBEKANNTEN, INDIREKTEN
MECHANISMUS 46
4.5 SOX9 INHIBIERT DIE APOPTOSE IN RBMSC, ABER NICHT IN RASC 48
4.6 SOX9 VERSTAERKT DIE PROLIFERATION IN RBMSC UND RASC 49
4.7 SOX9 BESCHLEUNIGT DEN EINTRITT IN DIE S-PHASE IN RBMSC UND RASC 50
4.8 EIN
PCR-BASIERTER MICROARRAY ZUR UNTERSUCHUNG VON ZELLZYKLUS-GENEN ZEIGT DIE
REGULIERUNG VON
SCHLAFEN-1, DDIT UND GPRL32 NACH SOX9 KNOCKDOWN IN RBMSC 52
4.9 DER EINFLUSS VON SOX9 AUF CYCLIN DL UND P21 IN RASC
UND RBMSC 53
VI
INHALTSVERZEICHNIS
4.10 SOX9-ABHAENGIGE REGULIERUNG DER ADIPOGENEN DIFFERENZIERUNG IN RBMSC
55
4.10.1 REDUKTION DER PROTEINEXPRESSION UND DESTABILISIERUNG DER MRNA VON
C/EBPSS NACH SOX9
KNOCKDOWN IN RBMSC 56
4.10.2 INHIBIERUNG DER EXPRESSION VON ADIPOGENEN MARKER NACH SOX9
KNOCKDOWN IN RBMSC 57
4.10.3 CYCLIN DL-UNABHAENGIGE C/EBPSS INHIBITION UND CYCLIN DL-ABHAENGIGE
INDUKTION VON P21 UND
OSTEOCALCIN IN -SOX9 RBMSC 58
4.11 UNTERSUCHUNG POTENTIELLER SIGNALWEGE IN RBMSC 59
4.11.1 DIE BLOCKIERUNG VON MEK1/2 MITTELS U0126 HAT KEINEN EINFLUSS AUF
DIE DIFFERENTIELLE EXPRESSION
VON CYCLIN DL, P21 UND C/EBPSS 59
4.11.2 DIE UNTERSUCHUNG ZENTRALER PROTEINE VERSCHIEDENER SIGNALWEGE
ERGIBT KEINE REPRODUZIERBARE
REGULIERUNG 60
4.11.3 EINE VERMINDERTE AKTIVIERUNG DER P38 MAPK SIGNALKASKADE NACH SOX9
KNOCKDOWN FUEHRT ZU
STABILISIERTEM CYCLIN DL PROTEIN 61
4.12 DIE ROLLE VON SOX9 WAEHREND DER CHONDROGENEN UND OSTEOGENEN
DIFFERENZIERUNG 62
4.12.1 OSTEOGENESE 63
4.12.1.1 VERSTAERKTE EXPRESSION OSTEOGENER MARKER WAEHREND DER IN VITRO
OSTEOGENESE IN -SOX9 RBMSC
UND RASC 63
4.12.1.2 VERSTAERKTE MINERALISIERUNG WAEHREND DER IN VITRO OSTEOGENESE IN
-SOX9 RASC UND TENDENZIELL
IN RBMSC 65
4.12.1.3 BESCHLEUNIGTER ANSTIEG DER ALKALISCHEN PHOSPHATASE AKTIVITAET
WAEHREND DER OSTEOGENESE IN
-SOX9 RBMSC 66
4.12.2 CHONDROGENESE IN RBMSC 67
4.12.2.1 EXPRESSION CHONDROGENER MARKER IN RBMSC 68
4.12.2.2 GROESSENMESSUNG DER AGGREGATE UND BEWERTUNG DER MORPHOLOGIE
(SCORING) IN RBMSC 70
4.12.2.3 HISTOLOGISCHE AUSWERTUNG DER RBMSC-AGGREGATE MITTELS ALCIANBLAU
FAERBUNG 72
5 DISKUSSION 73
5.1 BMSC VERSUS ASC 73
5.2 SOX9 REDUZIERT DIE APOPTOSE IN MSC VIA CASPASE- UND BCL-2 75
5.3 SOX9 BEEINFLUSST CYCLIN DL-ABHAENGIG DIE PROLIFERATION VIA P21 76
5.4 SOX9 BEEINFLUSST DAS DIFFERENZIERUNGSPOTENTIAL VON MSC 78
5.4.1 DER EINFLUSS VON SOX9 AUF DIE OSTEOGENE DIFFERENZIERUNG 78
5.4.2 DER EINFLUSS VON SOX9 AUF DIE ADIPOGENE DIFFERENZIERUNG 80
5.4.3 DER EINFLUSS VON SOX9 AUF DIE CHONDROGENE DIFFERENZIERUNG 81
5.5 DIE ROLLE VON SOX9 IM P38 MAPK-SIGNALWEG 83
ZUSAMMENFASSUNG 86
SUMMARY 88
ANHANG 90
DANKSAGUNG 90.
ERKLAERUNG 91
VII
INHALTSVERZEICHNIS
LEBENSLAUF (CURRICULUM VITAE) 92
VEROEFFENTLICHUNGEN 94
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 95
LITERATURVERZEICHNIS 98
|
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| spelling | Stöckl, Sabine Verfasser aut Der Einfluss von Sox9 auf Zellvitalität und Differenzierungspotential von adulten mesenchymalen Stammzellen vorgelegt von Sabine Stöckl, geb. Grötschel 2013 VIII, 106 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Regensburg, Univ., Diss., 2013 Mit einer Zssfassung in engl. Sprache Vitalität (DE-588)4188440-1 gnd rswk-swf Transkriptionsfaktor (DE-588)4303350-7 gnd rswk-swf Zelldifferenzierung (DE-588)4067536-1 gnd rswk-swf Mesenchymzelle (DE-588)4278308-2 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Mesenchymzelle (DE-588)4278308-2 s Transkriptionsfaktor (DE-588)4303350-7 s Zelldifferenzierung (DE-588)4067536-1 s Vitalität (DE-588)4188440-1 s DE-604 Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:355-epub-289419 http://epub.uni-regensburg.de/28941/ Verlag kostenfrei Volltext https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:355-epub-289419 Resolving-System DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=026819867&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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