Funktionelle und strukturelle Charakterisierung von Antikörpern gegen das Glykoprotein B des humanen Cytomegalovirus:
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INHALTSVERZEICHNIS 11
INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
2 SUMMARY 2
3 EINLEITUNG 3
3.1 DAS HUMANE CYTOMEGALOVIRUS (HCMV): KLASSIFIZIERUNG, MORPHOLOGIE UND
REPLIKATION . 3
3.2 EPIDEMIOLOGIE UND PATHOGENESE VON HCMV 6
3.3 DIE ZELLULAERE UND HUMORALE IMMUNANTWORT GEGEN HCMV 7
3.4 PROPHYLAXE UND THERAPIE GEGEN HCMV 8
3.5 GLYKOPROTEIN B VON HCMV 10
3.6 IMMUNANTWORT GEGEN HCMV GB 11
4 FRAGESTELLUNG 14
5 MATERIAL 15
5.1 REAGENZIEN, PLASTIK- UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 15
5.2 MEDIEN, PUFFER UND LOESUNGEN 15
5.2.1 NAEHRMEDIEN UND L OESUNGEN FUER BAKTERIEN 15
5.2.2 MEDIEN FUER ZELLKULTUR 16
5.2.3 PUFFER UND LOESUNGEN 16
5.3 BIOLOGISCHE MATERIALIEN 19
5.3.1 ZELLEN 19
5.3.2 VIREN 19
5.3.3 E. COLI STAEMME 19
5.3.4 PROTEINE UND PEPTIDE 20
5.4 NUKLEINSAEUREN 20
5.4.1 VEKTOREN UND PLASMIDE 20
5.4.2 OLIGONUKLEOTIDE 26
5.5 ENZYME 28
5.6 ANTIKOERPER 29
5.6.1 PRIMAERE ANTIKOERPER 29
5.6.2 SEKUNDAERE ANTIKOERPER 30
6 METHODEN 31
6.1 ZELLKULTURVERFAHREN 31
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IMAGE 2
II | INHALTSVERZEICHNIS
6.1.1 KULTIVIERUNG VON EUKARYONTEN ZELLEN 31
6.1.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON EUKARYONTEN ZELLEN 31
6.1.3 VIRUSREKONSTITUTION 32
6.2 VIROLOGISCHE METHODEN 32
6.2.1 VIRUSPROPAGIERUNG IN ZELLKULTUR 32
6.2.2 VIRUSTITRATION 32
6.2.3 BESTIMMUNG DER REPLIKATIONSKAPAZITAET VON VIREN 33
6.2.4 CELL-CELL-SPREAD -TEST 33
6.2.5 LUCIFERASE-BASIERTER IN VITRO NEUTRALISATIONSTEST 34
6.2.6 IN VITRO NEUTRALISATIONSTEST BASIEREND AUF IMMEDIATE EARLY-1
(IE-L)-EXPRESSION.... 34
6.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 35
6.3.1 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 35
6.3.2 COMBINED CHAIN REACTION (CCR) 36
6.3.3 DNA-GELELEKTROPHORESE 37
6.3.4 RESTRIKTIONSENZYMVERDAU VON DNA 37
6.3.5 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS DEM AGAROSEGEL 38
6.3.6 LIGATION VON DNA 38
6.3.7 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIEN 38
6.3.8 TRANSFORMATION VON E. COLI 39
6.3.9 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA. 39
6.3.10 ISOLIERUNG VON BAC-DNA 40
6.3.11 BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION 40
6.3.12 MARKERLESS MUTAGENESIS NACH TISCHER ET AL 41
6.3.13 EXTRAKTION VON DNA AUS INFIZIERTEN ZELLEN 43
6.3.14 SEQUENZIERUNG VON DNA 43
6.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 44
6.4.1 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 44
6.4.2 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 44
6.4.3 COOMASSIEBLUE-FAERBUNG 44
6.4.4 DEGLYKOSYLIERUNG MIT PNGASE F 45
6.4.5 ERZEUGUNG UND REINIGUNG VON FAB-FRAGMENTEN DURCH PAPAIN-SPALTUNG
45
6.4.6 SPALTUNG MIT THROMBIN 46
6.4.7 UEBEREXPRESSION VON PROTEINEN 46
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS | IM
6.4.8 REINIGUNG VON REKOMBINANT EXPRIMIERTEN PROTEINEN 48
6.4.8.1 AFTINITAETSREINIGUNG AN GLUTATHIONE SEPHAROSE 4B 48
6.4.8.2 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN NICKELAGAROSE 48
6.4.8.3 ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE 49
6.4.8.4 KATIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE 49
6.4.8.5 GROESSENAUSSCHLUSS-CHROMATOGRAPHIE 50
6.5 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 50
6.5.1 ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 50
6.5.2 BESTIMMUNG DER IGG KONZENTRATION 51
6.5.3 WESTERN BLOT ANALYSE 51
6.5.4 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ 52
6.5.5 KOVALENTE ANTIGENKOPPLUNG AN AMINOLINK PLUS 52
6.5.6 ANTIGENSPEZIFISCHE AFFINITAETSREINIGUNG VON SEREN 52
6.6 BIOPHYSIKALISCHE METHODEN 53
6.6.1 SURFACE PLASMON RESONANCE (SPR) 53
6.6.2 GRCULARDICHROISMUS (CD)-SPEKTROSKOPIE 53
6.7 TIEREXPERIMENTELLE METHODEN 53
7 ERGEBNISSE 55
7.1 AD-4-ANTIKOERPERTITER UND NEUTRALISATIONSKAPAZITAET HUMANER SEREN 55
7.2 EINFLUSS VON AD-4-SPEZIFISCHEN ANTIKOERPERN AUF CELL-CELL-SPREAD 58
7.2.1 REINIGUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER MIT AD-4-SPEZIFITAET AUS
HCMVHYPERIMMUNSEREN 59
7.2.2 CELL-CELL-SPREAD -TEST MIT HUMANEN AD-4-SPEZIFISCHEN ANTIKOERPERN
64
7.3 IMMUNISIERUNG VON CD8 V~ MAEUSEN MIT GB UND AD-4 66
7.3.1 IMMUNANTWORT NACH IMMUNISIERUNG 66
7.3.2 ANALYSE ZUR NEUTRALISATIONSKAPAZITAET VON MURINEN HYPERIMMUNSEREN
68
7.4 IDENTIFIZIERUNG ESSENTIELLER AMINOSAEURERESTE FUER DIE
ANTIKOERPERBINDUNG 72
7.4.1 BINDUNGSSPEZIFITAET VON AD-4-SPEZIFISCHEN HU-MABS 72
7.4.2 ANALYSEN ZUR AD-4-SPEZIFITAET NACH EINER INFEKTION MIT HCMV 82
7.4.3 GENERIERUNG UND REPLIKATIONSKAPAZITAET VON AD-4-VIRUSMUTANTEN 89
7.4.4 NEUTRALISATION VON AD-4-VIRUSMUTANTEN DURCH AD-4-SPEZIFISCHE
ANTIKOERPER 91
7.5 KRISTALLSTRUKTURANALYSEN ZU AD-4, SM5-LFAB UND AD-4 IM KOMPLEX MIT
SM5-LFAB 98
7.5.1 KRISTALLSTRUKTUR VON AD-4 99
IMAGE 4
IV | INHALTSVERZEICHNIS
7.5.2 KRISTALLSTRUKTUR VON SM5-LFAB 103
7.5.3 KRISTALLSTRUKTUR VON AD-4 IM KOMPLEX MIT SM5-LFAB 112
8 DISKUSSION 118
9 LITERATURVERZEICHNIS 136
10 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 161
PUBLIKATIONEN, PATENT, TEILNAHMEN AN KONGRESSEN 165
DANKSAGUNG 167
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