Charakterisierung der Genregulation des putativen Tumorsuppressors HECA beim oralen Plattenepithelkarzinom:
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 ECKDATEN DER KOPF-/HAI5TUMOREN 3
1.1.1 EPIDEMIOLOGIE 3
1.1.2 RISIKOFAKTOREN 4
1.1.3 KLINISCHES ERSCHEINUNGSBILD 4
1.1.4 MOLEKULARE PATHOGENESE 5
1.2 DER KANONISCHE WNT/B-CATENIN SIGNALWEG 7
1.2.1 MOLEKULARE GRUNDLAGEN 7
1.2.1.1 ALLGEMEINES 7
1.2.1.2 REZEPTOREN, AGONISTEN UND ANTAGONISTEN DES WNT/SS-CATENIN
SIGNALWEGS 7
1.2.1.3 GRUNDMODELL DER SIGNALTRANSDUKTION 9
1.2.1.4 REGULATORISCHE FUNKTIONEN DES TCF/LEF-KOMPLEXES 10
1.2.2 DYSREGULATION DES KANONISCHEN WNT-SLGNALWEGS BEIM OSCC 13
1.3 DASHECA-TUMORSUPPRESSORPROTEIN 14
1.3.1 ALLGEMEINE GRUNDLAGEN 14
1.3.2 FUNKTIONELLER KONTEXT HECAS AUF MOLEKULARER EBENE 15
1.3.2.1 DOWNSTREAM-REGULATION 15
1.3.2.2 UPSTREAM-REGULATION 17
2. ZIELSTELLUNG DER ARBEIT 19
3. MATERIAL UND METHODEN 20
3.1 ZEUKULTUR 20
3.1.1 VERWENDETE ZELLLINIEN 20
3.1.2 PCI 13-KULTUR 20
3.1.3 HOK-KUITUR 22
3.2 QUALITATIVER FAKTORENNACHWEIS MITTELS RT-PCR 23
3.2.1 PRINZIP 23
3.2.2 RNA ISOLATION 23
3.2.3 CDNA-SYNTHESE 24
3.2.4 PCR 25
3.2.5 ANALYSE MITTEIS GELELEKTROPHORESE 27
3.3 GENEXPRESSIONSANALYSE AUF TRANSLATIONSEBENE 28
3.3.1 PRINZIP 28
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS! II
3.3.2 HERSTELLUNG VON PROTEINLYSATEN 29
3.3.3 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 30
3.3.4 IMMUNOBLOT 31
3.3.4.1 GELHERSTELLUNG 32
3.3.4.2 SDS-PAGE UND BLOTTING 33
3.3.4.3 SPEZIFISCHER PROTEINNACHWEIS MITTELS ANTIKOERPER 33
3.3.5 DENSITOMETRISCHE AUSWERTUNG 35
3.4 CHROMATIN-IMMUNPRAZIPITATION 36
3.4.1 PRINZIP 36
3.4.2 HERSTELLUNG DER IMMUNPRAEZIPITIERTEN CHROMATINPROBEN 37
3.4.2.1 DNA-PROTEIN QUERVERNETZUNG UND CHROMATIN NUDEASEVERDAU 37
3.4.2.2 ANALYSE DES CHROMATINVERDAUS UND DER KONZENTRATION 39
3.4.2.3 IMMUNPRAEZIPITATION 39
3.4.2.4 WASCHEN DES IMMUNPRAEZIPITIERTEN CHROMATINS 40
3.4.2.5 ELUIERUNG DES CHROMATINS AUS DEN IMMUNKOMPLEXEN 42
3.4.2.6 DNA-AUFREINIGUNG 42
3.4.3 ANALYSE MITTELS QUANTITATIVER REAL-TIME-PCR (RT-QPCR) 43
3.4.3.1 PRINZIP 43
3.4.3.2 RT-QPCR MIT SEQUENZSPEZIFISCHEN FLUORESZENZSONDEN 44
3.4.3.3 RT-QPCR MIT SYBR GREEN I 46
3.4.3.4 AUSWERTUNG MITTELS RELATIVER QUANTIFIZIERUNG 48
4. ERGEBNISSE 49
4.1 GENEXPRESSIONSNACHWEIS AUF TRANSSKRIPTIONSEBENE 49
4.1.1 ERGEBNISSE DER PCI 13-ZELLLINIE 49
4.1.2 ERGEBNISSE DER HOK-ZELLLINIE 50
4.2 IMMUNOBLOT-ANALYSE 51
4.2.1 ERGEBNISSE DER PCI 13 ZELLLINIE 51
4.2.2 ERGEBNISSE DER HOK-ZELLLINIE 53
4.2.3 ZUSAMMENFASSENDER VERGLEICH ZWISCHEN PCI 13 UND HOK 55
4.3 UNTERSUCHUNG DER FAKTORBINDUNG IN DER HECA-PROMOTORREGION 56
4.3.1 ERGEBNISSE MIT UNBEHANDELTEN PCI 13-ZELLEN 56
4.3.1.1 RT-QPCR MIT UPL-SONDEN 56
4.3.1.2 RT-QPCR MIT SYBR GREEN 58
4.3.2 ERGEBNISSE NACH INKUBATION MRR DEM WNT-AGONISTEN BIO 59
4.3.3 ERGEBNISSE NACH INKUBATION MIT DEM WNT-ANTAGONISTEN FH535 60
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS! III
4.3.4 ERGEBNISSE MIT HOK-ZELLEN 61
5. DISKUSSION 62
5.1 DISKUSSION DER METHODEN 62
5.1.1 RT-PCR 62
5.1.2 IMMUNO-BLOT 63
5.1.3 CHIP-ASSAY 64
5.2 DISKUSSION DER ERGEBNISSE 67
5.2.1 REGULATION DER HECA-EXPRESSION DURCH DEN KANONISCHEN WNT-SIGNALWEG
67
5.2.2 REGULATION DER HECA-EXPRESSION DURCH SLUG 72
5.2.3 KUNISCHE RELEVANZ 75
6. ZUSAMMENFASSUNG 77
7. LITERATURVERZEICHNIS 78
8. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS 86
8.1 ABBILDUNGEN 86
8.2 TABELLEN 86
8.3 DIAGRAMME 87
9. ANHANG 88
9.1 LABORGERAETE 88
9.2 VERBRAUCHSMATERIAL 89
9.3 CHEMIKALIEN UND ENZYME 90
9.4 PRIMERBINDUNGSSTELLEN 92
9.5 LEBENSLAUF 93
9.6 DANKSAGUNG 94
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