Experimentelle Untersuchungen zur Ermittlung des Einflusses der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Maturation boviner Oozyten auf die globale DNA-Methylierung in Zygoten nach In-vitro-Fertilisation (IVF):
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| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen
DVG
2013
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
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1 EINLEITUNG 1
2 LITERATUR 3
2.1 IN-VITRO-PRODUKTION VON EMBRYONEN 3
2.1.1 BEDEUTUNG DES SAUERSTOFFS IN DER IN-VITRO-PRODUKTION VON
EMBRYONEN 5
2.1.1.1 AUSWIRKUNGEN UNTERSCHIEDLICHER SAUERSTOFFKONZENTRATIONEN
WAEHREND DER IN-VITRO-MATURATION VON OOZYTEN AUF DIE QUALITAET DER
EIZELLEN UND EMBRYONEN 8
2.1.1.2 AUSWIRKUNGEN UNTERSCHIEDLICHER SAUERSTOFFKONZENTRATIONEN
WAEHREND DER IN-VITRO-FERTILISATION UND DER IN-VITRO-KULTUR AUF DIE
QUALITAET DER RESULTIERENDEN EMBRYONEN 13
2.2 EPIGENETIK 18
2.2.1 DNA-METHYLIERUNG 19
2.2.1.1 DNA-METHYLIERUNG IN GAMETEN 20
2.2.1.2 DNA-METHYLIERUNG WAEHREND DER PRAEIMPLANTATORISCHEN
EMBRYONALENTWICKLUNG 23
2.2.1.2.1 DNA-METHYLIERUNG IN ZYGOTEN 23
2.2.1.2.2 DNA-METHYLIERUNG IN EMBRYONALEN FURCHUNGSSTADIEN 28
2.2.1.3 AUSGEWAEHLTE STUDIEN ZUR IMMUNZYTOCHEMISCHEN ANALYSE DER
GLOBALEN DNA-METHYLIERUNG IN KEIMZELLEN UND PRAEIMPLANTATORISCHEN
EMBRYONEN VERSCHIEDENER SAEUGETIERSPEZIES 30
2.2.2 HISTON-MODIFIKATIONEN 35
2.2.3 NICHT-KODIERENDE RNAS 36
2.2.4 VERAENDERUNGEN DES EPIGENOMS 36
2.2.4.1 BEEINFLUSSUNG EPIGENETISCHER MODIFIKATIONEN DURCH
UMWELTBEDINGUNGEN 37
2.2.4.2 BEEINFLUSSUNG DER DNA-METHYLIERUNG DURCH ASSISTIERTE
REPRODUKTIONSTECHNOLOGIEN 41
2.2.4.2.1 IN-VITRO-KULTUR 41
2.2.4.2.1.1 MEDIEN FUER DIE IN-VITRO-KULTUR 43
2.2.4.2.2 SOMATISCHER ZELLKERNTRANSFER ( KLONEN ) 44
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IMAGE 2
2.2.5 METHODEN ZUR ANALYSE DER DNA-METHYLIERUNG 45
2.2.5.1 METHYLIERUNGSSENSITIVE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 47
2.2.5.2 AFFINITAETSREINIGUNG METHYLIERTER DNA DURCH METHYIIERTE DNA
IMMUNOPRAEZIPITATION ODER METHYL-CPG-BINDENDE DOMAENEN
ENTHALTENDE PROTEINE 49
2.2.5.3 BISULFIT-BEHANDLUNG 51
2.2.5.4 MIKROARRAYS UND SEQUENZIERUNGSVERFAHREN 54
2.2.5.5 AUSGEWAEHLTE BEISPIELE ZUR GENOMWEITEN DNAMETHYLIERUNGSANALYSE IN
GAMETEN UND PRAEIMPLANTATORISCHEN
EMBRYONEN 56
2.2.5.6 IMMUNZYTOCHEMISCHE ANALYSE 57
2.2.5.7 AUSGEWAEHLTE BEISPIELE ZUR GENSPEZIFISCHEN
DNAMETHYLIERUNGSANALYSE IN GAMETEN UND PRAEIMPLANTATORISCHEN
EMBRYONEN 59
2.2.5.8 NACHWEIS DE 5-HYDROXYMETHYLCYTOSINS 61
3 MATERIAL UND METHODEN 63
3.1 IN-VITRO-PRODUKTION VON RINDEREMBRYONEN 63
3.1.1 GEWINNUNG VON KUMULUS-OOZYTEN-KOMPLEXEN 63
3.1.2 IN-VITRO-MATURATION 66
3.1.3 IN-VITRO-FERTILISATION 67
3.1.4 DENUDIERUNG 68
3.2 ETABLIERUNG EINES PROTOKOLLS ZUR IMMUNZYTOCHEMISCHEN DARSTELLUNG
DES 5-METHYLCYTOSINS IN IN VITRO PRODUZIERTEN PRAEIMPLANTATORISCHEN
EMBRYONEN DES RINDES 69
3.2.1 VORBEHANDLUNG DER EMBRYONEN 70
3.2.1.1 VERDAU DERZONA PELLUCIDA 71
3.2.1.2 HANDHABUNG DER EMBRYONEN 72
3.2.1.3 ERSTE FIXIERUNG 74
3.2.1.4 ERSTE PERMEABILISIERUNG 74
3.2.1.5 DENATURIERUNG DER DNA 75
3.2.1.6 NEUTRALISIERUNG 75
IMAGE 3
3.2.1.7 ZWEITE FIXIERUNG 76
3.2.1.8 ZWEITE PERMEABILISIERUNG 76
3.2.1.9 BLOCKIERUNG 76
3.2.2 INKUBATION MIT DEM ANTI-5-METHYLCYTIDINE-ANTIKOERPER
(PRIMAERANTIKOERPER) 78
3.2.3 INKUBATION MIT DEM SEKUNDAERANTIKOERPER 79
3.2.4 KONTROLLEN 80
3.3 ETABLIERUNG EINES FAERBEPROTOKOLLS ZUR DARSTELLUNG DES
GESAMTDNA-GEHALTES IN VITRO PRODUZIERTER PRAEIMPLANTATORISCHER
EMBRYONEN DES RINDES 81
3.3.1 PRUEFUNG VERSCHIEDENER FARBSTOFFE AUF IHRE EIGNUNG ZUR DARSTELLUNG
DES GESAMT-DNA-GEHALTES IN VITRO PRODUZIERTER ZYGOTEN DES
RINDES 82
3.3.1.1 VERSUCHE ZUR DARSTELLUNG DES GESAMT-DNA-GEHALTES MIT
4 ,6-DIAMIDINO-2-PHENYLINDOLE 85
3.3.1.2 VERSUCHE ZUR DARSTELLUNG DES GESAMT-DNA-GEHALTES MIT
PROPIDIUMIODID 87
3.3.1.3 VERSUCHE ZUR DARSTELLUNG DES GESAMT-DNA-GEHALTES MIT
HOECHST 33258 89
3.3.1.4 VERSUCHE ZUR DARSTELLUNG DES GESAMT-DNA-GEHALTES MIT
HOECHST 33342 91
3.3.1.5 VERSUCHE ZUR DARSTELLUNG DES GESAMT-DNA-GEHALTES MIT
ETHIDIUM HOMODIMER-1 94
3.3.1.6 VERSUCHE ZUR DARSTELLUNG DES GESAMT-DNA-GEHALTES MIT
ETHIDIUM HOMODIMER-2 96
3.4 EINFLUSS DER SAUERSTOFFKONZENTRATION WAEHREND DER IN-VITRO-REIFUNG
BOVINER OOZYTEN AUF DIE GLOBALE DNA-METHYLIERUNG IN VITRO
PRODUZIERTER ZYGOTEN 98
3.4.1 IN-VITRO-MATURATION BOVINER OOZYTEN BEI UNTERSCHIEDLICHEN
SAUERSTOFFKONZENTRATIONEN 98
IMAGE 4
3.4.2 IMMUNZYTOCHEMISCHE DARSTELLUNG DES 5-METHYLCYTOSINS IN IN VITRO
PRODUZIERTEN PRAEIMPLANTATORISCHEN EMBRYONEN DES RINDES 98
3.4.2.1 VORBEHANDLUNG DER EMBRYONEN 99
3.4.2.2 INKUBATION MIT DEM PRIMAER- UND SEKUNDAERANTIKOERPER 101
3.4.2.3 KONTROLLEN 102
3.4.3 DARSTELLUNG DES GESAMT-DNA-GEHALTES BOVINER EMBRYONEN MIT
HOECHST 33342 102
3.5 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 103
3.6 AUSWERTUNG DER FLUORESZENZBILDER MIT IMAGEJ 106
3.7 STATISTISCHE AUSWERTUNG 109
3.8 ALLGEMEINER VERSUCHSAUFBAU 110
3.8.1 VERSUCHSANORDNUNG 110
3.8.1.1 ETABLIERUNG EINES IMMUNZYTOCHEMISCHEN PROTOKOLLS ZUR DARSTELLUNG
DES 5-METHYLCYTOSINS IN IN VITRO PRODUZIERTEN PRAEIMPLANTATORISCHEN
EMBRYONEN DES RINDES 110
3.8.1.2 ETABLIERUNG EINES FAERBEPROTOKOLLS ZUR DARSTELLUNG DES
GESAMTDNA-GEHALTES IN BOVINEN IN VITRO PRODUZIERTEN ZYGOTEN 111
3.8.1.3 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES DER SAUERSTOFFKONZENTRATION WAEHREND
DER IN-VITRO-REIFUNG BOVINER OOZYTEN AUF DIE DNA-METHYLIERUNG IN
VITRO PRODUZIERTER ZYGOTEN 112
4 ERGEBNISSE 114
4.1 IN-VITRO-PRODUKTION BOVINER EMBRYONEN 114
4.2 ETABLIERUNG EINES IMMUNZYTOCHEMISCHEN PROTOKOLLS ZUR DARSTELLUNG
DES 5-METHYLCYTOSINS IN IN VITRO PRODUZIERTEN PRAEIMPLANTATORISCHEN
EMBRYONEN DES RINDES 114
4.2.1 VORBEHANDLUNG DER EMBRYONEN 117
4.2.1.1 VERDAU DERZONA PELLUCIDA 117
4.2.1.2 HANDHABUNG DER EMBRYONEN 120
4.2.1.3 ERSTE FIXIERUNG 121
4.2.2 INKUBATION MIT DEM ANTI-5-METHYLCYTIDINE-ANTIKOERPER
(PRIMAERANTIKOERPER) 122
IMAGE 5
4.2.3 INKUBATION MIT DEM SEKUNDAERANTIKOERPER 123
4.2.4 KONTROLLEN 123
4.3 ETABLIERUNG EINES FAERBEPROTOKOLLS ZUR DARSTELLUNG DES
GESAMTDNA-GEHALTES IN IN VITRO PRODUZIERTEN PRAEIMPLANTATORISCHEN BOVINEN
EMBRYONEN 125
4.3.1 EIGNUNG VERSCHIEDENER FARBSTOFFE ZUR DARSTELLUNG DES GESAMT-
DNA-GEHALTES IN BOVINEN IN VITRO PRODUZIERTEN ZYGOTEN 125
4.3.1.1 DARSTELLUNG DES GESAMT-DNA-GEHALTES MIT
4 ,6-DIAMIDINO-2-PHENYLINDOLE 125
4.3.1.2 DARSTELLUNG DES GESAMT-DNA-GEHALTES MIT PROPIDIUMIODID 126
4.3.1.3 DARSTELLUNG DES GESAMT-DNA-GEHALTES MIT HOECHST 33258 128
4.3.1.4 DARSTELLUNG DES GESAMT-DNA-GEHALTES MIT HOECHST 33342 130
4.3.1.5 DARSTELLUNG DES GESAMT-DNA-GEHALTES MIT ETHIDIUM HOMODIMER-1.132
4.3.1.6 DARSTELLUNG DES GESAMT-DNA-GEHALTES MIT ETHIDIUM HOMODIMER-2.134
4.4 AUSWIRKUNGEN DER SAUERSTOFFKONZENTRATIONEN WAEHREND DER
IN-VITROREIFUNG BOVINER EIZELLEN AUF DIE DNA-METHYLIERUNG IN VITRO
PRODUZIERTER ZYGOTEN 137
4.4.1 IN-VITRO-REIFUNG BOVINER EIZELLEN BEI UNTERSCHIEDLICHEN
SAUERSTOFFKONZENTRATIONEN 137
4.4.2 NICHT AUSGEWERTETE EMBRYONEN 139
4.4.3 VERGLEICH DES AUSMASSES DER METHYLIERUNG DES CYTOSINS IN DEN
MATERNALEN UND PATERNALEN VORKERNEN INNERHALB EINER
VERSUCHSGRUPPE SOWIE ZWISCHEN BEIDEN VERSUCHSGRUPPEN 141
4.4.3.1 NORMALISIERTE 5MC-SIGNALE DER ELTERLICHEN PRONUKLEI (REIFUNG BEI
5 % 0 2) 142
4.4.3.2 NORMALISIERTE 5MC-SIGNALE DER ELTERLICHEN PRONUKLEI (REIFUNG BEI
20 % O2) 143
4.4.3.3 NORMALISIERTE 5MC-SIGNALE DER MATEMALEN PRONUKLEI (REIFUNG BEI
5 % 0 2 UND BEI 20 % 02) 144
4.4.3.4 NORMALISIERTE 5MC-SIGNALE DER PATERNALEN PRONUKLEI (REIFUNG BEI
5 % 0 2 UND BEI 20 % 02) 145
IMAGE 6
4.4.3.5 NORMALISIERTE RELATIVE METHYLIERUNG DER PATERNALEN PRONUKLEI
(REIFUNG BEI 5 % O2 UND BEI 20 % O2) 146
5 DISKUSSION 147
5.1 DIE IMMUNZYTOCHEMIE ALS NACHWEISMETHODE DER GLOBALEN DNAMETHYLIERUNG
IN PRAEIMPLANTATORISCHEN EMBRYONEN 148
5.2 EINFLUSS DER IN-VITRO-MATURATION AUF DIE METHYLIERUNG DER DNA 154
5.3 SCHLUSSFOLGERUNGEN 161
6 ZUSAMMENFASSUNG 162
7 SUMMARY 167
8 VERZEICHNIS DER MEDIEN UND EINZELDATEN 171
8.1 MEDIEN FUER DIE IN-VITRO-PRODUKTION 171
8.1.1 MEDIEN FUER DIE IN-VITRO-MATURATION 171
8.1.2 MEDIEN FUER DIE IN-VITRO-FERTILISATION 175
8.1.3 MEDIEN FUER DIE IN-VITRO-KULTUR 179
8.2 MATERIALIEN FUER DIE IN-VITRO-PRODUKTION 182
8.3 MEDIEN FUER DIE IMMUNZYTOCHEMIE 184
8.4 MEDIEN FUER DIE FAERBUNG DER DNA 186
8.5 MATERIALIEN FUER DIE FAERBUNG DER ZYGOTEN 188
8.6 EINZELDATEN AUS DEM VERSUCHSTEIL 190
8.6.1 ANZAHL DER IN DEN VORVERSUCHEN VERWENDETEN EMBRYONEN 190
8.6.2 ANZAHL GEFAERBTER SOWIE AUSGEWERTETER EMBRYONEN NACH
IN-VITROREIFUNG BEI 5 % O2 UND BEI 20 % O2 190
8.6.3 ERGEBNISSE DER AUSWERTUNGEN MIT IMAGEJ 191
9 VERZEICHNIS DER ABKUERZUNGEN 193
10 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN 199
11 VERZEICHNIS DER TABELLEN 202
12 LITERATURVERZEICHNIS 206
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| spelling | Bennemann, Johanna Verfasser (DE-588)1037044339 aut Experimentelle Untersuchungen zur Ermittlung des Einflusses der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Maturation boviner Oozyten auf die globale DNA-Methylierung in Zygoten nach In-vitro-Fertilisation (IVF) vorgelegt von Johanna Bennemann 1. Aufl. Gießen DVG 2013 244 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Zugl.: Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss., 2013 cattle cabt reproduction cabt embryology cabt oxygen cabt DNA methylation cabt in vitro fertilization cabt oocyte maturation cabt (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=026126228&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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