Funktionelle Analyse und therapeutischer Knockdown von Pim-1 im kolorektalen Karzinom mittels RNAi und miRNA:
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
4
INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG 8
SUMMARY 10
1 EINLEITUNG 12
1.1 PIM-L 12
1.1.1 STRUKTUR 12
1.1.2 REGULATION 14
1.1.3 FUNKTION 15
1.1.4 PIM-L U N D TUMORIGENESE 17
1.1.5 PIM-L INHIBITOREN 21
1.2 KOLOREKTALES KARZINOM 22
1.2.1 PATHOGENESE 23
1.2.2 THERAPIE 25
1.3 RNA-INTERFERENZ 27
13.1 MECHANISMUS 28
1.3.2 IN ULTRA-EINSATZ VON SIRNA 31
1.4 MIRNA 33
1.4.1 MECHANISMUS 33
1.4.2 MIRNAS BEI D E R TUMORIGENESE 35
1.5 NANOPARTIKEL-BASIERTE IN VIVO-EINSCHLEUSUNG KLEINER NUKLEINSAEUREN 37
1.6 ZIELSETZUNG 40
2 MATERIALIEN U N D METHODEN 42
2.1 MATERIALIEN 42
2.1.1 GERAETE U N D ZUBEHOER 42
2.1.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 43
2.1.3 CHEMIKALIEN U N D CHEMOTHERAPEUTIKA 45
2.1.4 KITS, MARKER, ENZYME, GEBRAUCHSFERTIGE PUFFER U N D LOESUNGEN 47
2.1.5 PUFFER U N D LOESUNGEN EIGENER HERSTELLUNG 48
2.1.6 ANTIKOERPER U N D ANTIKOERPERLOESUNGEN 49
2.1.7 TRANSFEKTIONSREAGENZIEN 51
2.1.8 NUKLEINSAEUREN 51
2.1.9 ZELLLINIEN 53
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
5
2.1.10 PUFFER, MEDIEN U N D ZUSAETZE FUER DIE ZELLKULTUR 53
2.1.11 VERSUCHSTIERE U N D VERSUCHSTIERHALTUNG 54
2.2 METHODEN 55
2.2.1 ZELLKULTUR 55
2.2.1.1 KULTIVIERUNG 55
2.2.1.2 TRANSFEKTION 56
2.2.1.3 BEHANDLUNG MIT PIM-1 INHIBITOR CARB-13 58
2.2.1.4 BEHANDLUNG MIT ZYTOSTATIKA 58
2.2.1.5 WST-1 ASSAY ZUR BESTIMMUNG VON ZELLVIABILITAET U N D
PROLIFERATION 58
2.2.1.6 WEICHAGAR-ASSAY 59
2.2.1.7 ZELLZYKLUSANALYSE MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE 59
2.2.1.8 IN VIVO MAUSMODELLE 60
2.2.1.9 IN IROO-EINSCHLEUSUNG KLEINER, THERAPEUTISCHER NUKLEINSAEUREN 61
2.2.1.10 BIOVERTEILUNGSSTUDIEN 62
2.2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 6 3
2.2.2.1 HYBRIDISIERUNG DER MIRNA-EINZELSTRAENGE 63
2.2.2.2 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION VON RNA AUS ZELLEN U N D GEWEBE 63
2.2.23 ISOLIERUNG VON MIRNA A U S ZELLEN 64
2.2.2.4 REVERSE TRANSKRIPTION 65 ~
2.2.2.5 QRT-PCR 66
2.2.2.6 [ 32P]-MARKIERUNG V O N MIRNA 67
2.2.2.7 RNA-GELELEKTROPHORESE, NORTHERN BLOT U N D AUTORADIOGRAPHIE 68
2.2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 69
2.2.3.1 LUCIFERASE-ASSAY 69
2.2.3.2 APOPTOSE-ASSAY 69
2.2.3.3 BESTIMMUNG D E R SERUM-HDL-KONZENTRATION 70
2.2.3.4 AKTIVITAETSBESTIMMUNG DER LEBERENZYME ASAT, ALAT, YGT U N D A P
70
2.2.3.5 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN 71
2.2.3.6 ELISA 71
2.2.3.7 SDS-PAGE U N D WESTERN BLOTTING 73
2.2.3.8 IMMUNHISTOCHEMIE 75
2.2.3.9 STATISTIK 76
3 ERGEBNISSE 77
3.1 RNAI- U N D MIRNA-VERMITTELTE SUPPRESSION V O N PIM-1 78
3.2 ANTI-PROLIFERATIVER EFFEKT 8 1
3.2.1 VERANKERUNGSABHAENGIGES WACHSTUM 83
3.2.2 VERANKERUNGSUNABHAENGIGES WACHSTUM 85
3 J APOPTOSEINDUKTION 86
3.4 ANTITUMOR-EFFEKT 88
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS 6
3.4.1 H E M M U N G DES TUMORWACHSTUMS DURCH LOKALE APPLIKATION V O N
PEI/SIPIM-1 KOMPLEXEN 89
3.4.2 SYSTEMISCHE EINSCHLEUSUNG PEI-KOMPLEXIERTER MIRNAS IN SUBKUTANE
TUMORXENOTRANSPLANTATE 91
3.4.3 H E M M U N G DES TUMORWACHSTUMS DURCH SYSTEMISCHE APPLIKATION VON
PEI/SIPIM-1 U N D
PEI/MIR-33A KOMPLEXEN 95
3.5 SENSITIVIERUNG GEGEN 5-FLUOROURACIL 98
3.6 REGULATION VON PIM-1 DURCH MIR-15B 103
3.7 MOLEKULARE KONSEQUENZEN DES PIM-L-KNOCKDOWNS 105
3.8 PIM-1 IM GLIOBLASTOM 110
3.8.1 DESIGN VON PIM-1 SPEZIFISCHEN U1 ADAPTERN 110
3.8.2 PIM-L-DEPLETION IN GLIOBLASTOM-ZELLEN 112
3.8.3 ANTI-PROLIFERATIVER EFFEKT 113
3.8.4 APOPTOSEINDUKTION 115
3.8.5 ANTITUMOR-EFFEKT 116
4 DISKUSSION 121
4.1 PIM-1 ALS THERAPEUTISCHES ZIELMOLEKUEL IM KOLONKARZINOM 121
4.1.1 REGULATION VON PIM-1 DURCH SPEZIFISCHE SIRNA, MIRNA U N D
INHIBITOR CARB-13 121 4.1.2 ANTIPROLIFERATION U N D APOPTOSEINDUKTION
125
4.1.3 EINSATZ VON PEIF25-LMW Z U R LIEFERUNG VON MIRNA U N D SIRNA 127
4.1.4 ANTITUMOR-EFFEKT U N D ZYTOSTATIKASENSITIVITAET 127
4.1.5 MOLEKULARER KONSEQUENZEN DER H E M M U N G VON PIM-1 129
4.2 PIM-1 ALS THERAPEUTISCHES ZIELMOLEKUEL IM GLIOBLASTOM 133
5 LITERATURVERZEICHNIS 138
6 PUBLIKATIONEN 155
6.1 PUBLIKATIONEN IN WISSENSCHAFTLICHEN JOURNALEN 155
6.2 BUCHBEITRAEGE 155
6.3 TEILNAHME AN WISSENSCHAFTLICHEN TAGUNGEN 155
6.4 PUBLIZIERTE TAGUNGSBEITRAEGE 156
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS 7
7 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 157
8 ANHANG 163
8.1 VERZEICHNIS D E R AKADEMISCHEN LEHRER 163
8.2 DANKSAGUNG 164
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