Expression, Reinigung und kinetische Charakterisierung von löslichen Varianten der humanen Tyrosinase:
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| Sprache: | German |
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 ANATOMIE UND FUNKTION DER MENSCHLICHEN HAUT 2
1.1.1 EPIDERMIS 3
1.1.2 MELANOZYTEN 3
1.2 MELANIN UND MELANOGENESE 4
1.2.1 MELANIN 4
1.2.2 STRUKTUR UND FUNKTION DER MELANINE 5
1.2.3 MELANOGENESE 7
1.2.4 REGULATION DER MELANOGENESE 8
1.2.5 ANGEBORENE STOERUNG DER MELANOGENESE: ALBINISMUS 10
1.3 TYROSINASE 10
1.3.1 GENETISCHE ORGANISATION DER TYROSINASE 10
1.3.2 BIOSYNTHESE, REIFUNG UND LOKALISATION DER TYROSINASE 11
1.3.3 MOLEKULARE ANATOMIE DER HUMANEN TYROSINASE 13
1.3.4 REAKTIONSMECHANISMUS 17
1.4 TYROSINASE-HEMMSTOFFE 20
1.4.1 ANWENDUNGEN 20
1.4.2 HEMMUNG DER MELANOGENESE 20
1.4.3 STRUKTURBASIERTES WIRKSTOFFDESIGN 24
1.5 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 24
2 MATERIAL UND METHODEN 27
2.1 MATERIALIEN 27
2.1.1 CHEMIKALIEN 27
2.1.2 ANTIBIOTIKA, MEDIEN UND ZUSAETZE 28
2.1.3 INHIBITOREN 29
2.1.4 ENZYME 29
2.1.5 ANTIKOERPER 29
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IMAGE 2
2.1.6 FERTIGANSAETZE 29
2.1.7 VERBRAUCHSMATERIALIEN 30
2.1.8 LABORGERAETE 30
2.1.9 BAKTERIENSTAEMME UND ZELLLINIEN 32
2.1.10 PLASMIDE 32
2.1.11 OLIGONUKLEOTIDE (PRIMER) 32
2.1.11.1 MUTAGENESEPRIMER 32
2.1.11.2 SEQUENZIERUNGSPRIMER 34
2.1.12 COMPUTERPROGRAMME 34
2.2 METHODEN 35
2.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 35
2.2.1.1 KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN ESCHERICHIA COLI 35
2.2.1.2 HERSTELLUNG CHEMISCH KOMPETENTER BAKTERIEN 36
2.2.1.3 KOMPETENZKONTROLLE 37
2.2.1.4 HITZESCHOCK-TRANSFORMATION 37
2.2.1.5 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IN ANALYTISCHEN MASSSTAB 38
2.2.1.6 PHENOL-CHLOROFORM FAELLUNG VON DNA 38
2.2.1.7 BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION 38
2.2.1.8 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 39
2.2.1.9 ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN 39
2.2.1.10 SPALTUNG DOPPELSTRAENGIGER DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 39
2.2.1.11 DNA-FAELLUNG 40
2.2.1.12 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 40
2.2.1.13 POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR) 4 1
2.2.1.14 ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESE 42
2.2.1.15 DNA-SEQUENZIERUNG 42
2.2.2 METHODEN DER GENEXPRESSION MIT DER EUKARYOTISCHEN ZELLKULTUR 43
2.2.2.1 KULTIVIERUNG DER HUMANEN ZELLLINIEN HEK 293 UND A549 43
2.2.2.2 ZELLZAHLBESTIMMUNG 44
2.2.2.3 LICHTMIKROSKOPISCHE DOKUMENTATION 44
2.2.2.4 VORBEUGUNG UND ABTOETEN DER MYKOPLASMEN IN DER ZELLKULTUR 44
2.2.2.5 TRANSFEKTION 44
2.2.2.6 ZELLLYSE 46
IMAGE 3
2.2.2.7 ADAPTION AN NAEHRMEDIUM MIT SERUMERSATZ 46
2.2.2.8 KULTIVIERUNG DER ZELLEN UNTER SERUMFREIEN BEDINGUNGEN 47
2.2.2.9 KUPFERZUSATZ IN DER ZELLKULTUR 47
2.2.2.10 TEST DER INHIBITOREN IN DER ZELLKULTUR 48
2.2.2.11 METHODEN DER GENEXPRESSION MIT DER HEFE-ZELLKULTUR 48
2.2.2.12 HITZESCHOCK-TRANSFORMATION UND SELEKTION DER HEFE-ZELLEN 48
2.2.2.13 KULTIVIERUNG DER HEFEZELLEN IN YPGAL MEDIUM 49
2.2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 49
2.2.3.1 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 49
2.2.3.2 NATIVE GELE 5 1
2.2.3.3 AKTIVITAETSFAERBUNG VON PROTEINGELEN 5 1
2.2.3.4 COOMASSIEFAERBUNG VON PROTEINGELEN 5 1
2.2.3.5 SILBERFAERBUNG VON PROTEINGELEN 52
2.2.3.6 WESTERN-BLOT UND IMMUNCHEMISCHER NACHWEIS 52
2.2.3.7 PROTEINBESTIMMUNG NACH ABSORPTION BEI 280 NM 53
2.2.3.8 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 53
2.2.3.9 PROTEINBESTIMMUNG MIT BICINCHONINSAEURE 54
2.2.3.10 DEGLYKOSYLIERUNGSVERSUCH 54
2.2.3.11 VERSUCHE ZUR FALTUNG VON PROTEIN IN LOESUNG 55
2.2.3.12 ANKONZENTRIERUNG VON PROTEINLOESUNGEN 55
2.2.3.13 MELANIN-EXTRAKTION UND -MESSUNG 55
2.2.3.14 PROTEINEXTRAKTION AUS DEM SDS-GEL 55
2.2.3.15 MALDI-MS-ANALYSE 56
2.2.3.16 THERMAL-SHIFT-ASSAY 56
2.2.3.17 VERWENDUNG VON COMPUTERPROGRAMME FUER PROTEINANALYSE 56
2.2.4 CHROMATOGRAPHISCHE METHODE 57
2.2.4.1 ENTSALZEN UND PUFFERWECHSEL MIT SEPHADEX* G-25 57
2.2.4.2 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE MITTELS HIS-TAG 57
2.2.4.3 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE MITTELS STREP-TAG 58
2.2.4.4 LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE DES PILZENZYMS MITTELS
ANIONENAUSTAUSCHER 59
2.2.4.5 GELFILTRATION 59
2.2.5 KINETISCHE EXPERIMENTE 60
IMAGE 4
2.2.5.1 AKTIVITAETSNACHWEIS IN ZELLEXTRAKT 6 1
2.2.5.2 ERMITTLUNG DER KINETISCHEN PARAMETER NACH MICHAELIS-MENTEN 6 1
2.2.5.3 INHIBITORSTUDIEN 62
2.2.5.4 PH-ABHAENGIGKEIT DER INHIBITORISCHEN WIRKUNGEN 63
2.2.5.5 TROPFENTEST 63
2.2.6 KRISTALLOGRAPHISCHE METHODEN 63
3 ERGEBNISSE 65
3.1 EXPRESSION UND AUFREINIGUNG DER HUMANEN TYROSINASE 65
3.1.1 HUMANE TYROSINASE CDNA 65
3.1.2 EXPRESSION DER HUMANEN TYROSINASE IN HEFE-ZELLEN [K. LACTIS GG799)
65
3.1.2.1 KONSTRUKTION UND KLONIERUNG DES EXPRESSIONSVEKTORS 65
3.1.2.2 HERSTELLUNG DER EXPRESSIONSKASSETTE 67
3.1.2.3 SELEKTION UND EXPRESSION DER TYROSINASE 68
3.1.2.4 AUFREINIGUNG DER TYROSINASE AUS HEFEKULTUR 69
3.1.2.5 RUECKFALTUNGSVERSUCHE 70
3.1.3 EXPRESSION DER HUMANEN TYROSINASE IN EUKARYOTISCHER ZELLKULTUR 7 1
3.1.3.1 PROTEINEXPRESSION UNTER SERUMFREIEN BEDINGUNGEN 72
3.1.3.2 WIEDERDARSTELLUNG DER EXPRESSION IN HEK-ZELLEN MIT SERUMERSATZ
73
3.1.3.3 KUPFERIONENZUSATZ 75
3.1.4 AUFREINIGUNG DER VARIANTE HTYR-D HIS 76
3.1.5 MALDI-MS-ANALYSE 80
3.1.6 DEGLYKOSYLIERUNG 8 1
3.1.7 STABILITAET 82
3.1.8 NACHREINIGUNG DER PILZTYROSINASE ALS VORBEREITUNG FUER
KRISTALLISATIONS VERSUCHE 83
3.1.9 KRISTALLISATIONS-SCREENING 85
3.2 INHIBITORSTUDIEN 85
3.2.1 MESSVERFAHREN 85
3.2.2 AUSWERTUNG 87
3.2.3 KINETISCHE CHARAKTERISIERUNG EINZELNER INHIBITOREN 89
3.2.3.1 DERIVATE DER KOJISAEURE 90
3.2.3.2 MIMOSIN-DERIVATE 9 1
IMAGE 5
3.2.3.3 RHODANINE 92
3.2.3.4 PHENYLHYDRAZIDE 94
3.2.3.5 PHENYLPIPERAZINE 94
3.2.3.6 PHENYLMORPHOLINE 95
3.2.3.7 PHENYLTHIAZOLYLAMINE 96
3.2.4 PH-ABHAENGIGKEIT DER HEMMWIRKUNG 97
3.2.5 EINFLUSS VON INHIBITOREN AUF DIE MELANINPRODUKTION IN VIVO 100
3.3 MUTAGENESESTUDIEN ZUR UEBERPRUEFUNG DER HOMOLOGIEMODELLELOL
3.3.1 ENTWURF UND EXPRESSION DER MUTANTEN 102
3.3.2 MUTANTEN MIT VERAENDERUNGEN IN DER BINDETASCHE 103
3.3.3 MUTANTEN MIT VERAENDERTEN GLYKOSYLIERUNGSSTELLEN 105
4 DISKUSSION 107
4.1 OPTIMIERUNG DER EXPRESSION UND AUFREINIGUNG 107
4.1.1 EXPRESSION, AUFREINIGUNG UND RUECKFALTUNGEN IN HEFE-ZELLEN 109
4.1.2 EXPRESSION DER TYROSINASE IN DER HEK-ZELLEN 111
4.1.3 EXPRESSION UNTER SERUMFREIEN BEDINGUNGEN 112
4.1.4 EXPRESSION MIT KUPFER-ZUSATZ 112
4.1.5 AUFREINIGUNG DER EXPRIMIERTEN TYROSINASE-VARIANTEN 113
4.2 KINETIK UND HEMMUNG 115
4.2.1 MESSUNG DER DIPHENOLASE-AKTIVITAET 115
4.2.2 BINDUNGSMODUS VON TYROSINASE-INHIBITOREN 120
4.2.3 PH-ABHAENGIGKEIT DER HEMMWIRKUNG 122
4.2.4 ZYTOTOXIZITAET-TEST 123
4.3 MUTAGENESE 124
4.3.1 HOMOLOGIEMODELLE 124
4.3.2 MUTANTEN MIT VERAENDERUNGEN IN DER BINDETASCHE 129
4.3.3 MUTANTEN MIT VERAENDERUNGEN VON GLYKOSYLIERUNGSSTELLEN 131
4.4 KRISTALLISATIONSSCREENING 134
5 ZUSAMMENFASSUNG 135
IMAGE 6
6 SUMMARY 137
7 LITERATUR 139
8 ANHANG 162
8.1 ABKUERZUNGEN UND EINHEITEN 162
8.2 PLASMIDKARTEN 165
8.2.1 PLASMIDKARTE VON PCDNA 3.1/V5-HIS-TOPO 165
8.2.2 PLASMIDKARTE VON PKLAC2 166
8.3 CDNA DER HUMANEN TYROSINASE 167
8.4 ALIGMENT DER AMINOSURENSEQUENZEN VON TIERISCHEN
TYROSINASE UND TRPS 168
8.5 INHIBITOREN: TABELLARISCHE UEBERSICHT 169
8.6 PATENT UND PUBLIKATIONSLISTE 181
8.7 LEBENSLAUF 182
8.8 AKADEMISCHE LEHRERINNEN UND LEHRER 183
8.9 EHRENWOERTLICHE ERKLAERUNG 184
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