Einschluss des Nukleosidanalogons Gemcitabin in thermosensitive Liposomen zur temperaturgetriggerten Freisetzung: in vitro Untersuchung der Einschlussmodalitäten und Freisetzungskinetik
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS
CM I NHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS IV
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS VII
1 EINLEITUNG L
1.1 STRUKTURELLER AUFBAU VON LIPOSOMEN L
1.1.1 GRUNDBAUSTEINE DER LIPOSOMEN: PHOSPHOLIPIDE 1
1.1.2 PHASENUMWANDLUNGSTEMPERATUR TC 4
1.1.3 THERMOSENSITIVE LIPOSOMEN, TSL 4
1.1.3.1 DPPC, DSPC UND P-LYSO-PC 4
1.1.3.2 DPPGZ 6
1.1.4 ZETA-POTENZIAL (OBERFLAECHENLADUNG) UND GROESSE 7
1.2 GEMCITABIN (2 ,2 -DIFLUORO-2 -DEOXYCYTIDIN) 8
1.2.1 STRUKTUR UND WIRKMECHANISMUS VON GEMCITABIN 8
1.2.2 RESISTENZENTWICKLUNG 11
1.3 HYPERTHERMIE 12
1.3.1 HYPERTHERMIE UND CHEMOTHERAPIE 12
1.3.2 THERMOSENSITIVE LIPOSOMEN UND HYPERTHERMIE 13
1.3.3 HITZESCHOCKPROTEIN HSP70 UND GEMCITABIN 14
1.4 DAS PANKREASKARZINOM 15
1.4.1 DAS PANKREASKARZINOM AUS KLINISCHER SICHT 15
1.4.2 EINTEILUNG DER PANKREASNEOPLASIEN 15
1.4.3 PATHOGENESE DES PANKREASKARZIOMS 16
1.4.4 DIAGNOSTIK 16
1.4.5 STAGING 18
1.4.6 THERAPIEANSAETZE UND 5-JAHRES-UEBERLEBENSRATEN 18
1.5 AUFGABENSTELLUNG 20
2 MATERIAL UND METHODEN 21
2.1 MATERIALIEN 21
2.1.1 CHEMIKALIEN 21
2.1.2 VERWENDETE LOESUNGEN 21
2.1.3 ZELLKULTUR 22
I
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.2 METHODEN TEIL I HERSTELLUNG UND IN VITRO ANALYTIK VON GEMCITABIN-TSL
23
2.2.1 QUALITATIVER UND QUANTITATIVER NACHWEIS VON 2 -DEOXYURIDIN UND
GEMCITABIN | UV/VISSPEKTROMETRIE 23
2.2.2 THERMOSTABILITAET VON DU UND GEMCITABIN BEI HYPERTHERMIE 24 2.2.3
TEMPERATUISTABILITAET VON GEMCITABIN IN FETALEM KAELBEISERUM (FCS) 25
2.2.4 PH-METRIE 25
2.2.5 HALTBARKEIT VON GEMCITABIN 26
2.2.6 PRAEPARATION THERMOSENSITIVER LIPOSOMEN 26
2.2.7 UMPUFFERN MITTELS SAEULENCHROMATOGRAPHIE 27
2.2.8 QUALITAETSKONTROLLE: MITTELS PHOTONENKORIELATIONS-SPEKTROSKOPIE 27
2.2.9 LIPIDGEHALTBESTIMMUNG (PHOSPATBESTIMMUNG) 28
2.2.10 DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE 28
2.2.11 INDIREKTER EINSCHLUSS VON CF 28
2.2.12 BELADEN DER LIPOSOMEN MIT WIRKSTOFF 29
2.2.13 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DES EINGESCHLOSSENEN WIRKSTOFFS 29 2.2.14
TEMPERATUROEFFNUNGSKURVE DER GEMCITABINLIPOSOMEN 30
2.3 METHODEN TEIL II - ZELLKULTUR 32
2.3.1 ZELLLINIEN 32
2.3.2 ZELLZAHLBESTIMMUNG 33
2.3.3 KRYOKONSERVIERUNG 33
2.3.4 EINFRIERVORGANG 34
2.3.5 AUFTAUEN 34
23.6 MYCOPLASMENTEST 35
2.3.7 WACHSTUMSVERHALTEN DER INDIVIDUELLEN ZELLLINIEN - ERMITTELN ICSO
35 2.3.8 GEMCITABINEMPFINDLICHKEIT DER INDIVIDUELLEN ZELLLINIEN (ICSO)
37
3 ERGEBNISSE 38
3.1 TEIL I - HERSTELLUNG UND ANALYTIK VON GEMCITABIN-TSL 38
3.1.1 QUALITATIVER UND QUANTITATIVER NACHWEIS VON 2 -DEOXYURIDIN UND
GEMCITABIN | UV/VISSPEKTROMETRIE 38
3.1.1.1 ERGEBNISSE FUER DU 39
3.1.1.2 ERGEBNISSE FUER GEMCITABIN 40
3.1.2 STABILITAET VON DU UND GEMCITABIN BEI HYPERTHERMIE 42
3.1.3 STABILITAET VON GEMCITABIN IN FETALEM KAELBERSERUM (FCS) 43 3.1.4
PH-METRIE 44
3.1.5 GEMCITABIN - HALTBARKEIT 44
3.1.6 QUANTITATIVER NACHWEIS DES EINGESCHLOSSENEN WIRKSTOFFS
(DU/GEMCITABIN) 45
3.1.7 QUALITAETSKRITERIEN 46
3.1.7.1 GRUESSE, ZETAPOTENZIAL UND POLYDISPERSIONSINDEX (PDI) 46 3.1.7.2
DUNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE (DC) 48
3.1.8 DIREKTER EINSCHLUSS 50
3.1.8.1 DU-LIPOSOMEN 50
N
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.9 INDIREKTER TEMPERATURABHAENGIGER EINSCHLUSS 50
3.1.9.1 VORVERSUCH MIT CF-LIPOSOMEN 50
3.1.9.2 GEMCITABINEINSCHLUSS IN GLUCOSE-5%-HAITIGE LIPOSOMEN 51 3.1.9.3
EINSCHLUSS MIT VERSCHIEDENEN LIPIDKONZENTRATIONEN 53 3.1.9.4
GEMCITABINEINSCHLUSS IN HN-PUFFER-HALTIGE UND QTRAT-HALTIGE LIPOSOMEN 55
3.1.10 ZUSAMMENFASSUNG DER VERSUCHSREIHEN ZUM INDIREKTEN
GEMCITABINEINSCHLUSS 57
3.1.11 TEMPERATUROEFFNUNGSKURVE 59
3.2 TEIL II - ZELLKULTUR 61
3.2.1 MIA PACA2-ZELLEN 61
3.2.2 FG-ZELLEN 62
3.2.3 L3.6-ZELLEN 64
3.2.4 GEMCITABINBEHANDLUNG MIT FREIEM WIRKSTOFF - ERMITTLUNG DER IC50 65
3.2.4.1 MIAPACA2 65
3.2.4.2 FG 66
3.2.4.3 L3.6 67
4 DISKUSSION 68-
4.1 TEIL I - HERSTELLUNG UND ANALYTIK VON GEMCITABIN-TSL THERMOSENSITIVE
LIPOSOMEN AUS DPPC/DSPC /DPPG2 50:20:30 (M/M) 68
4.1.1 GROESSE DER VESIKEL 69
4.1.2 PH-METRIE 69
4.2 2 -DEOXIURIDIN (DU) 70
4.3 GEMCITABINNACHWEIS 70
4.4 HALTBARKEIT VON GEMCITABIN 71
4.5 METHODEN FUER DEN WIRKSTOFFEINSCHLUSS IN TSL 71
4.5.1 GLUCOSE-5%-LIPOSOMEN ALS BASIS DER GEMCITABIN-TSL 73 4.5.2
HN-PUFFER- UND GTRAT-PUFFER-LIPOSOMEN ALS BASIS DER GEMCITABIN-TSL 74
4.5.3 INTERAKTION VON GEMCITABIN MIT DEN PHOSPHOLIPIDEN 75
4.5.4 EINSCHLUSSEFFIZIENZ 76
4.6 TEMPERATUROEFFNUNGSVERHALTEN VON GEMCITABIN-TSL 77
4.7 TEIL II - ZELLKULTUR 78
5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 79
6 LITERATURVERZEICHNIS 80
DANKSAGUNG 87
LEBENSLAUF 88
M
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