Expressions- und Immunogenitätsstudien einer neuen Generation sequenzmodifizierter HIV-1 Subtyp B gagpolnef DNA Vakzinekandidaten:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
ERKLAERUNG
ZUSAMMENFASSUNG
1. EINLEITUNG 1
1.1. EPIDEMIOLOGIE 1
1.2. VIROLOGIE UND PATHOGENESE 1
1.2.1. VIRUSAUFBAU 1
1.2.2. REPLIKATIONSZYKLUS UND MORPHOGENESE 5
1.2.3. INFEKTIONSVERLAUF 6
1.2.4. PATHOGENITAETSFAKTOREN 9
1.3. HIV-VAKZINE 10
1.3.1. HERAUSFORDERUNGEN DER HLV-LMPFSTOFFENTWICKLUNG 10
1.3.2. ANFORDERUNGEN UND ALLGEMEINE ANSAETZE EINER HIV-VAKZINE 11
1.3.3. HLV-VAKZINESTRATEGIEN: KONZEPTE FUER DIE ENTWICKLUNG
EINES HIV-IMPFSTOFFES 13
1.3.4. DNA-VAKZINE 16
1.4. ZIELSETZUNG 18
1.4.1. VORAUSGEHENDE ARBEITEN 18
1.4.2. FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG DER VORLIEGENDEN ARBEIT 19
2. MATERIALIEN UND METHODEN 20
2.1. BAKTERIEN 20
2.1.1. BAKTERIENSTAEMME 20
2.1.2. NAEHRMEDIEN 20
2.1.3. HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN 21
2.1.4. TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN E. COLI 21
2.2. DNA 21
2.2.1. DNA-PLASMIDPRAEPARATION UND -AUFREINIGUNG AUS BAKTERIEN 21
2.2.1.1. PLASMIDVEKTOREN 21
2.2.1.1.1. PCR-SCRIPTTM SK(+)-PLASMID (AMP R ) 21
2.2.1.1.2. PCDNA3.1-EXPRESSIONSPLASMID 22
HTTP://D-NB.INFO/1038401755
IMAGE 2
2.2.1.2. PLASMIDISOLIERUNG 22
2.2.1.2.1. RAPID LYSIS 22
2.2.1.2.2. NUCLEOBOND-SAEU EN AX100/ AX500 22
2.2.1.2.3. HERSTELLUNG ENDOTOXINFREIER DNA 23
2.2.1.2.4. PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 23
2.2.2. DNA-KLONIERUNGSVERFAHREN UND -SYNTHESE 23
2.2.2.1. PCR 23
2.2.2.1.1. OLIGONUKLEOTIDE 24
2.2.2.1.2. STANDARD-PCR 24
2.2.2.1.3. QUICKCHANGE-MUTAGENESE 25
2.2.2.1.4. FUSIONS-PCR 25
2.2.2.1.5. COLONY-SCREENING 26
2.2.2.2. ENZYMATISCHE SPALTUNG 26
2.2.2.2.1. RESTRIKTIONSENZYME 26
2.2.2.2.2. DNA-MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS 26
2.2.2.2.3. RESTRIKTIONSVERDAU VON PLASMID-DNA 26
2.2.2.3. DNA-SEQUENZIERUNG 27
2.2.3. DNA-FRAGMENTISOLIERUNG AUS AGAROSE-GEL 27
2.2.3.1. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 27
2.2.3.2. AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN 27
2.2.4. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 28
2.3. ZELLKULTUR 28
2.3.1. EUKARYOTISCHE ZELLLINIEN UND NAEHRMEDIEN 28
2.3.2. ZELLKULTURTECHNIKEN 29
2.3.2.1. BESTIMMUNG DER LEBENDZELLZAHL 29
2.3.2.2. LAGERUNG EUKARYOTISCHER ZELLLINIEN 29
2.3.2.3. CAP04-TRANSFEKTION VON ADHAERENTEN H1299 UND 293TZELLEN 29
2.3.2.4. ERNTE UND AUFSCHLUSS DER ZELLEN 30
2.3.3. PROTEINANALYSE 30
2.3.3.1. PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG NACH BRADFORD-BIORAD... 30
2.3.3.2. AUFTRENNUNG DER PROTEINE MITTELS
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 31
2.3.3.3. WESTERN-BLOT-ANALYSE 32
IMAGE 3
2.3.3.3.1. FIXIERUNG DER PROTEINE AUF NITROZELLULOSEMEMBRAN.. 32
2.3.3.3.2. PANCEAUROTFARBUNG 33
2.3.3.4. ANTIKOERPERVERMITTELTE PROTEINDETEKTION 33
2.4. IMMUNOLOGISCHE STUDIEN 34
2.4.1. VERSUCHSTIERE 34
2.4.2. INTRAMUSKULAERE IMMUNISIERUNG VON BALB/C-MAEUSEN 34
2.4.3. AUSLESE DER HUMORALEN IMMUNANTWORT 34
2.4.3.1. SERUMGEWINNUNG 34
2.4.3.2. BESTIMMUNG DER ANTIKOERPER-TITER: GAG-SPEZIFISCHER
AK-ELISA 35
2.4.4. AUSLESE DER ZELLULAEREN IMMUNANTWORT 36
2.4.4.1. PRAEPARATION UND ISOLIERUNG VON MILZZELLEN 36
2.4.4.2. PEPTIDE ZUR RESTIMULATION 37
2.4.4.3. ELISPOT-ASSAY: QUANTIFIZIERUNG IFNY-SEZEMIERENDER
ZELLEN 37
2.4.4.4. FACS-ANALYSE: QUANTIFIZIERUNG DER INTRAZELLULAEREN
INFY-PRODUKTION STIMULIERTER CD8 + -LYMPHOZYTEN 38
3. ERGEBNISSE 40
3.1.KLONIERUNG 40
3.1.1. AUSGANGSKONSTRUKTE 40
3.1.1.1. GPNPR- 40
3.1.1.2. GAG 41
3.1.1.3. GPPR+ 41
3.1.2. KLONIERUNG DER KONSTRUKTVARIANTEN 41
3.1.2.1. GAGPOLNEF V3-KONSTRUKTREIHE 41
3.1.2.1.1. FRAMESHIFT-KONSTRUKTE 42
GPN FS PR- UND GPN FS PR- V3
GPN FS PR+ UND HIB GPN FS PR+ V3
3.1.2.1.2. PROTEASE-KONSTRUKTE 43
GPN PR- UND GPN PR- V3
GPN PR+/- UND GPN PR+/- V3
GPN PR+ UND GPN PR+ V3
3.1.2.1.3. NEF-KONSTRUKTE 44
IMAGE 4
GP ANEF PR- UND GP ANEF PR- V3
GP ANEF PR+ V3
3.1.2.1.4. GAGPOL-KONSTRUKTE 45
GP UND GP V3
3.1.2.1.5. KURZZUSAMMENFASSUNG 45
3.1.2.2. POLNEF V3-KONSTRUKTREIHE 46
3.1.2.2.1. PN FS PR- 47
3.1.2.2.2. PN PR- V3 UND PN PR+/- V3 47
3.1.2.2.3. POL ANEF PR-V3 47
3.1.2.2.4. KURZZUSAMMENFASSUNG 48
3.1.2.3. ZUSAMMENFASSUNG 48
3.2. ANALYSE DER PROTEINEXPRESSION IN H1299 49
3.2.1. DETEKTION DER PROTEINEXPRESSION 49
3.2.1.1. FUNKTIONSNACHWEIS DER GAGPOLNEF V3-KONSTRUKTREIHE 50
3.2.1.1.1. GPN FS PR-UND GPN FS PR-V3 50
3.2.1.1.2. UEBRIGE GAGPOLNEF V3-KONSTRUKTVARIANTEN 50
3.2.1.1.3. EINFLUSS DES FRAMESHIFTS AUF DIE PROTEINEXPRESSION.. 52
3.2.1.1.4. EINFLUSS DER PROTEASE AUF DIE PROTEINEXPRESSION 54
3.2.1.1.5. EINFLUSS VON NEF AUF DIE PROTEINEXPRESSION 55
3.2.1.2. DETEKTION DER PROTEINEXPRESSION DER POLNEF V3-KONSTRUKTREIHE
3.2.1.2.1. EINFLUSS DER PROTEASE AUF DIE PROTEINEXPRESSION 56
3.2.1.2.2. EINFLUSS VON NEF AUF DIE PROTEINEXPRESSION 57
3.2.1.2.3. EINFLUSS VON GAG AUF DIE PROTEINEXPRESSION 57
3.2.1.3. KURZZUSAMMENFASSUNG 57
3.3. IMMUNOLOGISCHE STUDIEN 58
3.3.1. IMMUNISIERUNGSPLAN DER BALB/C MAEUSE 59
3.3.2. BESTIMMUNG DER HUMORALEN IMMUNANTWORT: ANTIKOERPERANTWORT
IM ELISA 59
3.3.3. BESTIMMUNG DER ZELLULAEREN IMMUNANTWORT 62
3.3.3.1. ELISPOT-ANALYSE 62
3.3.3.2. FACS-ANALYSE 65
3.3.4. KURZZUSAMMENFASSUNG 68
3.4. ZUSAMMENFASSUNG 69
IMAGE 5
4. DISKUSSION 71
4.1. BISHERIGE STUDIEN UND ERGEBNISSE 71
4.2. EXPRESSIONSSTUDIEN 73
4.2.1. EINFLUESSE DER GAGPOLNEF-KONSTRUKTREIHE IN VITRO 73
4.2.1.1. BEDEUTUNG DER VIRALEN PROTEASE IN VITRO 73
4.2.1.1.1. FUNKTIONSWEISE 73
4.2.1.1.2. AKTIVE PROTEASE UND ZYTOTOXISCHE EFFEKTE 73
4.2.1.1.3. AKTIVE PROTEASE UND VORLAEUFERPROTEINE 74
4.2.1.1.4. AKTIVE PROTEASE UND DER NATUERLICHE FRAMESHIFT 74
4.2.1.1.5. ATTENUIERTE PROTEASE 75
4.2.1.1.6. INAKTIVE PROTEASE 75
4.2.1.2. BEDEUTUNG DES NATUERLICHEN FRAMESHIFT IN VITRO 76
4.2.1.2.1. FUNKTIONSWEISE 76
4.2.1.2.2. FRAMESHIFT VS. DURCHLESE: GAGPOL-VORLAEUFERPROTEINE. 76
4.2.1.2.3. FRAMESHIFT VS. DURCHLESE: GAG-EXPRESSION 77
4.2.1.2.4. FRAMESHIFT: AKTIVE VS. INAKTIVE PROTEASE 78
4.2.1.2.5. DURCHLESE: AKTIVE VS. INAKTIVE PROTEASE 78
4.2.1.3. BEDEUTUNG VON NEF IN VITRO 78
. 4.2.2. EINFLUESSE DER POLNEF-KONSTRUKTREIHE IN VITRO 80
4.2.2.1. PN UND DIE PROTEASEAKTIVITAET 80
4.2.2.2. POL ANEF 80
4.2.3. GAGPOLNEF- VS. POLNEF-PANEL (V3-DETEKTION) 81
4.3. IMMUNOGENITAETSSTUDIEN AM BALB/C MAUSMODELL 81
4.3.1. INDUKTION HUMORALER UND ZELLULAERER IMMUNANTWORTEN 82
4.3.1.1. EINFLUSS DER VIRALEN PR AUF DIE IMMUNOGENITAET 83
4.3.1.2. EINFLUSS DES FRAMESHIFTS AUF DIE IMMUNOGENIAET 84
4.3.1.3. EINFLUSS VON NEF AUF DIE IMMUNOGENITAET 85
4.3.1.4. EINFLUSS VON POLNEF AUF DIE IMMUNOGENITAET 86
4.4. AKTUELLE ARBEITEN DER ARBEITSGRUPPE 88
4.5. AUSBLICK 89
5. LITERATURVERZEICHNIS 92
6. LEBENSLAUF 100
IMAGE 6
7. DANKSAGUNG 102
8. ANHANG 103
8.1.0LIGONUKLEOTIDE
8.2. PEPTIDE
8.3. VEKTOREN
8.4. NUKLEOTIDSEQUENZEN
8.5. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
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| spelling | Röttger, Lydia 1980- Verfasser (DE-588)1036691039 aut Expressions- und Immunogenitätsstudien einer neuen Generation sequenzmodifizierter HIV-1 Subtyp B gagpolnef DNA Vakzinekandidaten vorgelegt von Lydia Röttger 2012 127 Bl. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Regensburg, Univ., Diss., 2013 HIV (DE-588)4200792-6 gnd rswk-swf Immunogenität (DE-588)4278029-9 gnd rswk-swf Impfstoff (DE-588)4026655-2 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content HIV (DE-588)4200792-6 s Impfstoff (DE-588)4026655-2 s Immunogenität (DE-588)4278029-9 s b DE-604 Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:355-epub-284033 http://epub.uni-regensburg.de/28403/ Verlag kostenfrei Volltext https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:355-epub-284033 Resolving-System DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=026098754&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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