Rationales und kombinatorisches Protein-Engineering mit Lipocalinen:
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS
III
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG I
1.1 LIPOCALINE ALS GERUESTPROTEINE FUER DAS PROTEIN-ENGINEERING 1
I. I. I VARIANTEN DES BILIN-BINDUNGSPROTEINS (BBP) 3
1. 1.2 DAS BAKTERIELLE LIPOCALIN (BLC) AUS E. COLI 6
1.2 DAS ANTICALIN DIGA16(H86N) ALS FUSIONSPARTNER MIT REPORTER-ENZYMEN 8
1.3 STRATEGIEN FUER DAS OE-/VOVO-DESIGN VON ENZYMEN 16
1.3.1 THEORIE DES UEBERGANGSZUSTANDES ENZYMATISCH KATALYSIERTER
REAKTIONEN 16
1.3.2 UEBERGANGSZUSTANDSANALOGA ALS TARGETS FIIR BINDUNGSPROTEINE 18
1.3.3 /FL-S///CO-DESIGN NEUARTIGER ENZYME 20
1.3.4 GENETISCHE/N-C/VO-SELEKTION 22
1.4 AUFGABENSTELLUNG 25
2 MATERIAL UND METHODEN 26
2.1 MATERIAL 26
2.1.1 E. COLI STAEMME UND BAKTERIOPHAGEN 26
2.1.2 PLASMIDE 27
2.1.3 OLIGODESOXYNUKLEOTIDE 27
2.1.4 ENZYME UND ANDERE PROTEINE 29
2.1.5 CHEMIKALIEN 30
2.1.6 STANDARDS UND KITS 34
2.1.7 GERAETE 35
2.1.8 VERBRAUCHSMATERIAL 40
2.1.9 MEDIEN 42
2.1.10 PUFFER UND LOESUNGEN 44
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 48
2.2.1 KULTIVIERUNG VON E. COLI STAEMMEN 48
2.2.2 TRANSFORMATION VON E. COLI MIT PLASMID-DNA 48
2.2.2.1 TRANSFORMATION NACH DER CACH-METHODE 49
2.2.2.2 TRANSFORMATION DURCH ELEKTROPORATION 50
2.2.3 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 51
2.2.3.1 PLASMID-MINIPRAEPARATIONEN 51
2.2.3.2 PLASMID-MIDIPRAEPARATIONEN 51
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IMAGE 2
IV
INHAL TS VERZEICHNIS
2.2.3.3 ISOLIERUNG VON EINZELSTRAENGIGER PLASMID-DNA AUS E. COLI 32
2.2.4 GELELEKTROPHORESE UND REINIGUNG VON DNA 33
2.2.4.1 ANALYTISCHE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 33
2.2.4.2 PRAEPARATIVE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 54
2.2.4.3 DENATURIERENDE HARNSTOFFFPOLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 35
2.2.4.4 REINIGUNG VON DNA DURCH PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION 56
2.2.5 ENZYMATISCHE REAKTIONEN MIT DNA 57
2.2.5.1 SPALTUNG DOPPELSTRAENGIGER DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 57
2.2.5.2 LIGIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 58
2.2.5.3 PHOSPHORYLIERUNG UND DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 58
2.2.5.4 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 59
2.2.6 ORTSGERICHTETE MUTAGENESE NACH KUNKEL 60
2.2.7 SEQUENZIERUNG DOPPELSTRAENGIGER DNA 61
2.3 GENTECHNISCHE METHODEN 62
2.3.1 PRODUKTION REKOMBINANTER PROTEINE IN E. COLI 62
2.3.1.1 PROTEIN-PRODUKTION IM 2 L-MASSSTAB 63
2.3.1.2 PROTEIN-PRODUKTION IM LABORFERMENTER 63
2.3.2 /N-FRVO-SELEKTION MIT LIPOCALIN-BIBLIOTHEKEN IN E. COLI 65
2.3.3 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 66
2.3.4 CHROMATOGRAPHISCHE VERFAHREN 67
2.3.4.1 IMMOBILISIERTE METALLCHELAT-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE (IMAC) 67
2.3.4.2 STREPTAVIDIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 68
2.3.4.3 GRUESSENAUSSCHLUSS-CHROMATOGRAPHIE 68
2.3.5 BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATION 69
2.3.6 KONZENTRIERUNG VON PROTEINEN 69
2.3.7 DIGOXIGENIN-MARKIERUNG VON TRAEGERPROTEINEN 70
2.3.8 ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 70
2.3.8.1 DIREKTER ELISA 70
2.3.8.2 KOMPETITIVER ELISA 72
2.3.9 ENZYMKINETIK 73
2.4 BIOPHYSIKALISCHE METHODEN 74
2.4.1 FLUORESZENZTITRATION 74
2.4.2 CD-SPEKTROSKOPIE 76
2.4.3 OBERFLAECHEN-PLASMONRESONANZ (BIACORE) 79
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
V
2.4.4 ISOTHERME TITRATIONSKALORIMETRIE (ITC) 81
2.S SOFTWARE UND DATENBANKEN 82
3 ERGEBNISSE 83
3.1 KONSTRUKTION EINER ZUFALLSBIBLIOTHEK AUF DER BASIS DES BAKTERIELLEN
LIPOCALINS 83
3.1.1 AUSWAHL VON AMINOSAEUREPOSITIONEN FUER DIE ZUFALLSMUTAGENESE 83
3.1.2 VORBEREITUNG EINES EXPRESSIONSVEKTORS 86
3.1.3 KONZERTIERTE MUTAGENESE DER AUSGEWAEHLTEN AMINOSAEUREPOSITIONEN 94
3.1.4 OPTIMIERUNG ENZYMATISCHER SCHRITTE ZUR ERZEUGUNG DER
PLASMID-BIBLIOTHEK 98
3.1.5 OPTIMIERUNG DER TRANSFORMATION VON E. COLI DURCH ELEKTROPORATION
101
3.1.6 KONSTRUKTION EINES EXPRESSIONSVEKTORS FUER
/N-K/VO-SELEKTIONSEXPERIMENTE 104
3.1.7 VERBESSERUNG DES EXPRESSIONSSYSTEMS IN HINBLICK AUF VERRINGERTE
CYTOTOXIZITAET 106
3.1.8 HERSTELLUNG DER EXPRESSIONSBIBLIOTHEK FUER BLC-VARIANTEN 111
3.2 HERSTELLUNG EINER ZUFALLSBIBLIOTHEK AUF DER BASIS DES
BILIN-BINDUNGSPROTEINS 116
3.3 STRATEGIEN ZUR IN- K/VO-SELEKTION VON PROTEINEN MIT ENZYMATISCHER
AKTIVITAET 119
3.3.1 GEEIGNETE ENZYM-MODELLSUBSTRATE FUR/N-K/VO-SELEKTIONSEXPERIMENTE
119
3.3.2 AUSWAHL GEEIGNETER E. COLI STAEMME FUER DIE /N-KJVO-SELEKTION 126
3.3.3 OPTIMIERUNG GEEIGNETER MINIMALMEDIEN 130
3.3.4 SELEKTIONSEXPERIMENTE AUS NAIVEN LIPOCALIN-BIBLIOTHEKEN 132
3.3.5 VERSUCHE ZUR EVOLUTION DURCH WIEDERHOLTE ZYKLEN VON SELEKTION UND
ZUFALLSMUTAGENESE 138
3.4 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DES ANTICALINS DIGA16(H86N) MIT
BINDUNGSAKTIVITAET FLIR DIGOXIGENIN 143
3.4.1 BAKTERIELLE PRODUKTION UND REINIGUNG VON DIGA16(H86N) 143
3.4.2 UNTERSUCHUNG DER LIGANDEN-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN VON DIGA16(H86N)
144
3.5 FUSIONSPROTEINE AUS DEM ANTICALIN DIGA 16(H86N) UND DER SS-LACTAMASE
AMPC
AUS ENTEROBACTER CLOACAE 147
3.5.1 ENTWICKLUNG DES EXPRESSIONSVEKTORS 148
3.5.2 HETEROLOGE PRODUKTION UND REINIGUNG DES FUSIONSPROTEINS
DIGA 16(H86N)-AMPC2 150
3.5.3 BIOCHEMISCHE UND FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DES
FUSIONSPROTEINS
DIGA 16(H86N)-AMPC2 152
IMAGE 4
VI
INHALTSVERZEICHNIS
3.6 FUSIONSPROTEINE AUS DEM ANTICALIN DIGA16(H86N) UND DER BAKTERIELLEN
ALKALISCHEN PHOSPHATASE 157
3.6.1 BAKTERIELLE PRODUKTION UND REINIGUNG DER FUSIONSPROTEINE 158
3.6.2 BIOCHEMISCHE UND FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG 159
4 DISKUSSION 165
4.1 STRATEGIEN ZUM EVOLUTIVEN DE-A OVO-DESIGN KATALYTISCHER PROTEINE 165
4.1.1 KONSTRUKTION HOCHKOMPLEXER LIPOCALIN-ZUFALLSBIBLIOTHEKEN 165
4.1.2 ETABLIERUNG POTENTIELL GEEIGNETER/N-KRVO-SELEKTIONSBEDINGUNGEN 167
4.2 DAS ANTICALIN DIGA16(H86N) 171
4.3 FUSIONSPROTEINE DES DIGA16(H86N) MIT BAKTERIELLEN SS-LACTAMASEN 173
4.4 FUSIONSPROTEINE DES DIGA16(H86N) MIT DER ALKALISCHEN PHOSPHATASE AUS
E. COLI 177
4.5 AUSBLICK 180
5 ZUSAMMENFASSUNG 181
6 LITERATURVERZEICHNIS 183
7 ABKUERZUNGEN 202
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