Intrazellulärer Transport von Zilium-assoziierten Proteinen:
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I EINLEITUNG 1
1 POLYZYSTISCHE NIEREN 1
1.1 AUTOSOMAL-DOMINANTE FORM DER POLYZYSTISCHEN NIERENERKRANKUNG 2
1.2 POLYCYSTIN-2 3
1.2.1 LOKALISATION UND FUNKTION VON POLYCYSTIN-1 UND POLYCYSTIN-2 3
1.2.2 POLYCYSTIN-2 FUNGIERT ALS NICHT-SELEKTIVER KATIONEN-KANAL 4
1.2.3 INTRAZELLULAERE LOKALISATION VON WILDTYP-POLYCYSTIN-2 UND SEINER
MUTANTEN 4
2 PRIMAERES ZILIUM 6
2.1 FUNKTION UND AUFBAU DES PRIMAEREN ZILIUMS 7
2.2 BASALKOERPERCHEN 9
2.3 HYPOTHETISCHE FUNKTIONEN DER STRUKTURELLEN HAUPTBESTANDTEILE 10
2.3.1 ,UEBERGANGSFASERN (TRANSITION FIBERS BZW. ALAR SHEETS) 12
2.3.2 ,BASALE FUESSCHEN- UND KAPPENSTRUKTUREN ( BASALFEET ANDCAPS) 13
2.3.3 ,GESTREIFTE WURZELFASERN (STRIATED ROOTLETS) 13
3 TRANSPORT VON MEMBRANPROTEINEN 13
3.1 INTRAFLAGELLARER TRANSPORT (IFT) 14
3.2 TRANSPORT VON MEMBRANPROTEINEN IN DAS PRIMAERE ZILIUM 14
4 LIVE CELL IMAGING UND ELEKTRONENMIKROSKOPIE - KEIN WIDERSPRUCH 17
4.1 /-V/VO-FAERBUNG MITTELS FLASH 18
4.2 KORRELATIVE LICHT- UND ELEKTRONENMIKROSKOPIE MITTELS REASH 18
5 3D-VISUALISIERUNG MITTELS ELEKTRONENTOMOGRAPHIE VON
HOCHDRUCKGEFRORENEN PROBEN 19
6 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 20
II MATERIAL U N D M E T H O D E N 2 1
1 MATERIALIEN 21
1.1 CHEMIKALIEN 21
1.2 MOLEKULARMASSENSTANDARDS 22
1.3 ENZYME/KOMMERZIELLE PUFFER 23
1.4 ANTIKOERPER 24
1.5 DNA 24
1.5.1 VEKTOREN UND PLASMID-DNA-KONSTRUKTE 24
1.5.2 OLIGONUKLEOTIDE 26
1.6 ZELLEN 2 7
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
1.6.1 BAKTERIEN 27
1.6.2 IMMORTALISIERTE SAEUGER-ZELLLINIEN 27
1.7 KITS 28
2 MOLEKULARGENETISCHE METHODEN 29
2.1 AUFREINIGUNG VON PLASMIDEN 29
2.1.1 PLASMID-DNA-MINIPRAEPARATION AUS E. COLI 29
2.1.2 PLASMID-DNA-MIDIPRAEPARATION AUS E. COLI 30
2.2 BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION 31
2.3 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 31
2.3.1 ELEKTROELUTION 32
2.4 ARBEITEN ZUR KLONIERUNG 32
2.4.1 AUFKONZENTRIERUNG VON DNA 32
2.4.2 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA 33
2.4.3 HERSTELLUNG VON GLATTEN PLASMID-DNA-ENDEN 33
KLENOW DNA POLYMERASE 34
T4 DNA POLYMERASE 34
2.4.4 DEPHOSPHORYLIERUNG VON VEKTOR-DNA MITTELS BAKTERIELLER ALKALISCHER
PHOSPHATASE (BAP) 35
2.4.5 LIGATION 35
LIGATION VON FRAGMENTEN MIT UEBERHAENGENDEN ENDEN 36
LIGATION VON GLATTEN ENDEN 36
2.4.6 SEQUENZIERUNG 36
2.5 ARBEITEN MIT BAKTERIEN 37
2.5.1 KULTIVIERUNG UND LAGERUNG 37
2.5.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN 37
TSS-PROTOKOLL (CHUNG ET AL., 1989) 37
ELEKTROKOMPETENTE ZELLEN 38
2.5.3 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN 38
TSS-PROTOKOLL (CHUNG ET AL., 1989; HANAHAN ET AL., 1983) 38
ELEKTROPORATION 39
2.6 ARBEITEN MIT IMMORTALISIERTEN ZELLLINIEN 39
2.6.1 KULTIVIERUNG UND PASSAGIEREN 39
AUFTAUEN VON ZELLEN 40
KULTIVIEREN UND PASSAGIEREN VON ZELLEN 40
EINFRIEREN VON ZELLEN 41
2.6.2 PLASMID-DNA TRANSFEKTION VON ZELLEN 41
TRANSIENTE TRANSFEKTION MIT LIPOFECTAMINE* 2000 41
TRANSIENTE TRANSFEKTION MIT DEAE-DEXTRAN 42
STABILE TRANSFEKTION 43
2.6.3 INDUKTION DER PROTEINPRODUKTION BEI STABIL TRANSFIZIERTEN ZELLEN
45
2.6.4 HERSTELLEN VON GANZZELL-LYSAT ZUR PROTEINEXTRAKTION 45
2.6.5 IMMUNZYTOCHEMIE 46
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
2.6.6 /-V/VO-FAERBUNG MITTELS FLASH 4 7
3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 48
3.1 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 48
3.2 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 49
3.2.1 HERSTELLUNG DER GELE 49
3.2.2 PROBENVORBEREITUNG 50
3.2.3 ELEKTROPHORESEBEDINGUNGEN 50
3.3 WESTERN-BLOT 50
3.3.1 ELEKTROBLOT VON PROTEINEN AUF PVDF-MEMBRAN 50
3.3.2 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS 51
4 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE PRAEPARATIONSMETHODEN 52
4.1 KONVENTIONELLE PRAEPARATION DER ZELLEN 54
4.1.1 ZELLKULTUR 54
4.1.2 CHEMISCHE FIXIERUNG 54
4.1.3 NACHFIXIERUNG UND KONTRASTIERUNG 55
4.1.4 ENTWAESSERUNG 55
4.1.5 INFILTRIERUNG UND EINBETTUNG IN KUNSTHARZ 56
4.2 KRYPO-PRAEPARATION DER ZELLEN 58
4.2.1 VORBEREITUNG 59
REINIGUNG DER SAPHIRPLAETTCHEN 59
BESCHICHTUNG DER SAPHIRPLAETTCHEN 59
4.2.2 ZELLKULTUR 59
4.2.3 HOCHDRUCKGEFRIEREN 60
4.2.4 GEFRIERSUBSTITUTION MIT CHEMISCHER FIXIERUNG 61
STANDARDPROGRAMM 62
VERKUERZTES PROGRAMM 62
4.2.5 INFILTRATION UND EINBETTUNG IN EPON 62
4.3 ULTRAMIKROTOMIE 63
4.3.1 ENTFERNEN DER AUFWACHSMATERIALIEN VON EINGEBETTETEN ZELLEN 64
ABLOESEN DER N-DISHES 64
ABSPRENGEN DER TRAEGER INKL. SAPHIRPLAETTCHEN 64
4.3.2 TRIMMEN DER KUNSTSTOFF-BLOECKCHEN 64
4.3.3 VORBEREITUNG DER GRIDS 65
4.3.4 HERSTELLUNG VON SEMI-UND ULTRADUENNSCHNITTEN 65
HERSTELLUNG VON SERIENSCHNITTEN 66
4.3.5 KONTRASTIERUNG UND FAERBUNG VON SCHNITTEN 66
KONTRASTIERUNG VON ULTRADUENNSCHNITTEN 66
FAERBUNG VON SEMIDUENNSCHNITTEN 67
5 MIKROSKOPIE 67
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
5.1 LICHTMIKROSKOPIE 67
5.2 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 68
5.3 ELEKTRONENMIKROSKOPIE 68
6 ELEKTRONEN-TOMOGRAPHIE 68
7 3D-REKONSTRUKTION MIT IMOD 69
8 3D-MODELIE - VISUALISIERUNG DER REKONSTRUIERTEN
ELEKTRONENTOMOGRAPHISCHEN DATENSAETZE 69
9 KORRELATIVE LICHT- UND ELEKTRONENMIKROSKOPIE 69
9.1 KLONIERUNG VON TC-KONSTRUKTEN 70
9.2 ZELLKULTUR 70
9.3 REASH-FAERBUNG: TETRACYSTEIN-BASIERTE PROTEINDETEKTION 71
9.4 PHOTOKONVERSION MIT DIAMINOBENZIDIN (DAB) 72
9.5 NACHFIXIERUNG UND KONTRASTIERUNG MIT 0 S 0 4 73
9.6 ENTWAESSERUNG, INFILTRATION UND EINBETTUNG IN EPON/DURCUPAN 74
9.7 ULTRAMIKROTOMIE 74
9.8 ELEKTRONENMIKROSKOPIE 75
III ERGEBNISSE 7 6
1 ETABLIERUNG DER TETRACYSTEIN-BASIERTEN PROTEIN-DETEKTIONSMETHODE
MITTELS FLASH* UND REASH*76
1.1 GENERIERUNG STABILER ZELLLINIEN FUER DIE TETRACYSTEIN-BASIERTE
PROTEINDETEKTION 77
1.2 TETRACYSTEIN-BASIERTE PROTEINDETEKTION MITTELS FLASH* 80
1.3 TETRACYSTEIN-BASIERTE PROTEINDETEKTION MITTELS REASH* 82
2 ETABLIERUNG DER KORRELATIVEN LICHT- UND ELEKTRONENMIKROSKOPIE MITTELS
REASH* 83
2.1 TRANSIENTE PROTEIN-EXPRESSION FUER DIE TETRACYSTEIN-BASIERTE
DETEKTION MITTELS REASH* 83
2.2 GOLGI-TRANSPORT UND ZYTOPLASMAMEMBRAN-LOKALISATION 84
2.2.1 POLYCYSTIN-2 (1/703)-DELETIONSMUTANTE 85
2.2.2 POLYCYSTIN-2-TRIPLE-ALANIN-MUTANTEN 88
2.2.3 VOLLLAENGEN-POLYCYSTIN-2 91
2.3 ZILIEN-TRANSPORT 94
2.3.1 POLYCYSTIN-2 (1/703)-DELETIONSMUTANTE 94
3 MORPHOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DES PRIMAEREN ZILIUMS 97
3.1 DARSTELLUNG DER BASIS VON PRIMAEREN ZILIEN NACH CHEMISCHER FIXIERUNG
98
3.1.1 TEM-TOMOGRAPHIE VON KONVENTIONELL PRAEPARIERTEN NIERENEPITHELZELLEN
99
3.2 TEM-UNTERSUCHUNGEN VON 200 NM-SEMIDUENNSCHNITTEN VON
HOCHDRUCKGEFRORENEN, GEFRIER
SUBSTITUIERTEN NIERENEPITHELZELLEN 100
3.3 3D-REKONSTRUKTIONEN VON HOCHDRUCKGEFRORENEN, GEFRIERSUBSTITUIERTEN
NIERENEPITHELZELLEN 103
3.4 3D-VISUALISIERUNGEN ANHAND TEM-TOMOGRAPHISCHER AUFNAHMEN 108
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
IV DISKUSSION 1 1 2
1 DISKUSSION DER ANGEWANDTEN TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPISCHEN
METHODEN 113
1.1 KORRELATIVE LICHT- UND ELEKTRONENMIKROSKOPIE 113
1.2 TOMOGRAPHIE 117
1.3 KRYO-FIXIERUNG UND GEFRIERSUBSTITUTION 118
1.4 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPISCHE ANALYSE 119
2 DISKUSSION DER IN DER VORLIEGENDEN ARBEIT BESCHRIEBENEN ERGEBNISSE 121
2.1 TRANSPORT DES INTEGRALEN MEMBRANPROTEINS POLYCYSTIN-2 121
2.1.1 POLYCYSTIN-2 (1/703)-DELETIONSMUTANTE 122
2.1.2 POLYCYSTIN-2-TRIPLE-ALANIN-MUTANTEN 124
2.1.3 VOLLLAENGEN-POLYCYSTIN-2 125
V Z U S A M M E N F A S S U N G 1 2 8
VI A N H A N G 1 3 0
1 BEISPIEL ZUR WIEDERFINDUNG VON REASH-PHOTOKONVERTIERTEN ZELLEN 130
2 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 132
3 ORDNERSTRUKTUR DER BEGLEIT-CD 135
VII LITERATURVERZEICHNIS 1 3 6
VIII PUBLIKATIONEN 1 5 3
IX CURRICULUM VITAE 1 5 4
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