Herstellung und Charakterisierung der Extrazellulardomäne des murinen Tumornekrosefaktor-Rezeptor Typ 2:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2012
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I INHALTSVERZEICHNIS
I INHALTSVERZEICHNIS I
II ABBILDUNGSVERZEICHNIS III
III ABKFIRZUNGSVERZEICHNIS IV
1 EINLEITUNG 1
1.1 TUMORNEKROSEFAKTOR 2
1.1.1 MOLEKULARE EIGENSCHAFTEN VON TUMORNEKROSEFAKTOR 2
1.1.2 FUNKTIONEN VON TUMORNEKROSEFAKTOR 3
1.1.3 TUMORNEKROSEFAKTOR IM PATHOGENETISCHEN KONTEXT 3
1.2 TUMORNEKROSEFAKTOR-REZEPTOREN 6
1.2.1 INTERAKTION DER TUMORNEKROSEFAKTOR-REZEPTOREN MIT IHREN LIGANDEN 6
1.2.2 TUMORNEKROSEFAKTOR-REZEPTOR TYP 1 8
1.2.3 TUMORNEKROSEFAKTOR-REZEPTOR TYP 2 9
1.2.4 ISOFORMEN DES TUMORNEKROSEFAKTOR-REZEPTOR TYP 2 11
1.3 TNF- UND ANTI-TNF-THERAPIE 11
2 MATERIAL 14
2.1 APPARATUREN 14
2.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 15
2.3 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 15
2.4 PUFFER UND LOESUNGEN 16
2.5 ANTIKOERPER 19
2.6 ZELLEN 19
2.7 KULTURMEDIEN UND ANTIBIOTIKA 19
2.8 PLASMIDVEKTOR MIT INTEGRIERTER SEQUENZ DER TNFR2-ED 20
3 METHODEN 22
3.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 22
3.1.1 TRANSFORMATION MITTELS HITZESCHOCK 22
3.1.2 SELEKTION TRANSFORMIERTER E. COLI BAKTERIEN 22
3.1.3 INDUKTION DER GENEXPRESSION TRANSFORMIERTER E. COLI BAKTERIEN 23
I
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IMAGE 2
3.1.4 PROTEINEXTRAKTION AUS E. COLI BAKTERIEN 24
3.1.5 REINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE 25
3.1.6 PROTEINCHEMISCHE ANALYSE 27
3.1.6.1 SODIUMDODECYLSULFAT-POIYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 27
3.1.6.2 SEMI-DRY-BLOT 29
3.1.6.3 PROTEINDETEKTION 30
3.1.7 COOMASSIE FAERBUNG 31
3.2 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 31
3.2.1 ARBEITEN MIT L929-ZELLEN 31
3.2.2 PASSAGIEREN VON L929-ZELLEN 31
3.2.3 AUSSAAT VON L929-ZELLEN IN 96-LOCH-PLATTEN 32
3.2.4 TNF-INDUZIERTER ZYTOTOXIZITAETSASSAY 32
3.2.5 TNF-ABHAENGIGER VITALITAETSASSAY (TNF-HEMMTEST) 34
4 ERGEBNISSE 35
4.1 ZIEL DER VORLIEGENDEN ARBEIT 35
4.2 EXPRESSION DER SEQUENZ DER MAUS TNFR2 EXTRAZELLULARDOMAENE 36
4.3 EXTRAKTION UND REINGEWINNUNG DER MAUS TNFR2 EXTRAZELLULARDOMAENE 40
4.3.1 VERSUCHE ZUR PROTEIN-REINGEWINNUNG UNTER NATIVEN BEDINGUNGEN 40
4.3.2 VERSUCHE ZUR PROTEIN-REINGEWINNUNG UNTER DENATURIERENDEN 41
BEDINGUNGEN
4.4 BESTIMMUNG DER BIOLOGISCHEN AKTIVITAET DER MAUS TNFR2 46
EXTRAZELLULARDOMAENE
4.4.1 ERMITTLUNG EINER GEEIGNETEN MAUS-TNF KONZENTRATION ALS 46
VERSUCHSGRUNDLAGE
4.4.2 AKTIVITAETSBESTIMMUNG MITTELS TNF-ABHAENGIGEM VITALITAETSASSAY 48
5 DISKUSSION 52
5.1 ASPEKTE DER GENEXPRESSION UND DER PROTEINREINIGUNG 52
5.2 ZUR BIOLOGISCHE AKTIVITAET DES REKOMBINANTEN PROTEINS 55
6 ZUSAMMENFASSUNG 58
7 LITERATURVERZEICHNIS 59
8 DANKSAGUNG 71
9 LEBENSLAUF 72
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