Domänenarchitektur inhibitorischer Ionenkanäle der Cys-Loop-Rezeptorfamilie:
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
PUBLIKATIONEN 3
INHALTSVERZEICHNIS 4
I. ZUSAMMENFASSUNG 7
II. EINLEITUNG 9
11.1 DIE NEURONALE SIGNALUEBERTRAGUNG 9
DAS NERVENSYSTEM 9
DIE NERVENZELLE 9
DIE CHEMISCHE SYNAPSE 9
11.2 DIE SUPERFAMILIE DER LIGANDENGESTEUERTEN IONENKANAELE 10
MITGLIEDER UND DEREN EINTEILUNG 10
ARCHITEKTUR DER CYS-LOOP-REZEPTOREN 11
BIOSYNTHESE, ASSEMBLIERUNG & TRANSPORT 12
11.3 DER GLYCINREZEPTOR 13
UNTEREINHEITEN DES GLYCINREZEPTORS 13
DIE INTRAZELLULAERE TM3-4 SCHLEIFE 14
GLYCINERGE SIGNALLEITUNG UND POSITIONIERUNG AN DER SYNAPSE 16
STOERUNGEN DES GLYCINERGEN SYSTEMS BEI NEUROLOGISCHEN ERKRANKUNGEN 17
GLYR-MUTATIONEN IN TIERMODELLEN 18
11.4 DER GABAA-REZEPTOR 19
EIGENSCHAFTEN DES GABAA-REZEPTORS 19
UNTEREINHEITEN DES GABAA-REZEPTORS 20
EPILEPSIE-ASSOZIIERTE MUTATIONEN DES GABAA-REZEPTORS 21
III. MATERIAL UND METHODEN 2 3
111.1 MATERIAL..: 23
KITS: KOMMERZIELLE REAGENZIENSAETZE 23
PROTEINE, VEKTOREN & ZELLEN 23
CHEMIKALIEN 24
PRIMER 25
ANTIKOERPER 26
VERBRAUCHSMATERIALEN 27
GERAETE UND SOFTWARE 27
111.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 29
RNA-ISOLATION UND DNASE-VERDAU 29
ERST-STRANG-SYNTHESE (RT-PCR) 29
PCR (ENGL. POLYMERASE CHAIN REACTION) 30
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 31
GELEXTRAKTION 32
KLONIERUNG 32
RESTRIKTIONSVERDAU 33
PHOSPHATASE - BEHANDLUNG DER VEKTOREN 33
LIGATION 34
TRANSFORMATION 34
4
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
BAKTERIENKULTUREN UND ANLEGEN VON STOCKS 35
ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 35
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA/RNA IM PHOTOMETER 36
111.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 37
PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD (IM PHOTOMETER) 37
SDS-POLYACRYLAMID (PAA) - GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 38
WESTERN BLOT ANALYSE 39
WESTERN BLOT 39
PONCEAU-ROT-FAERBUNG 40
IMMUNFAERBUNG 41
VERSTAERKTE (ENGL, ENHANCED) CHEMILUMINESZENZ-REAKTION (ECL) 42
SDS-GANZZELLLYSATE VON HEK293-ZELLEN 42
MEMBRANPROTEINPRAEPARATION 42
BIOTINYLIERUNGSASSAY: DETEKTION VON ZELLOBERFLAECHENPROTEINEN 43
KOIMMUNPRAEZIPITATION (KO-IP) 44
IMMUNZYTOCHEMIE (IC) 46
IMMUNZYTOCHEMISCHE LIVE FAERBUNG 47
111.4 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 47
KULTIVIERUNG VON HEK293-ZELLEN 47
PRAEPARATION VON PRIMAEREN RUECKENMARKSNEURONEN 48
KULTIVIERUNG VON PRIMAEREN NEURONEN 49
TRANSFEKTION VON HEK293-ZELLEN NACH DER CALCIUMPHOSPHAT-METHODE 49
111.5 ELEKTROPHYSIOLOGIE 50
111.6 VERSUCHSTIERE 54
VERSUCHSTIERE & HALTUNG 54
GENOTYPISIERUNGEN 54
GEWEBEPRAEPARATION 56
GEWEBELYSATE 56
KRYOTOMSCHNITTE UND IMMUNHISTOCHEMIE (IHC) 56
VIBRATOMSCHNITTE 57
IV. ERGEBNISSE 5 8
IV.1. FUNKTIONELLE IN VITRO KOMPLEMENTATION DES GLYRS AUS UNABHAENGIG
EXPRIMIERTEN DOMAENEN 58
GENERIERUNG DIVERSER GLYR-DOMAENEN 58
LOKALISATION DER KOMPLEMENTATIONSKONSTRUKTE IN DEN ZELLMEMBRANEN 61
PHYSIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DES ZWEI-DOMAENEN-GLYRS 63
ORIENTIERUNG DER IDA62-TM4 DOMAENE INNERHALB DER ZELLMEMBRAN 65
DREI-DOMAENEN-KONFIGURATION DER GLYRAL-UNTEREINHEIT 66
PROTEIN-INTERAKTIONEN DER GLYCINREZEPTORDOMAENEN 69
BEDEUTUNG DER GELADENEN AMINOSAEUREN INNERHALB DER TM3-4 SCHLEIFE 71
IV.2. TRANSGENE MAEUSE-WIEDERHERSTELLUNG DER GLYR-FUNKTION IN VIVO 73
GENOTYPISIERUNGEN 74
DETEKTION DER TRANSGENEN RNA 75
PROTEINDETEKTION IM WESTERN BLOT 77
PROTEINDETEKTION IN GEWEBESCHNITTEN 80
PROTEINDETEKTION IN PRIMAEREN RUECKENMARKSNEURONEN 83
UNTERSUCHUNG DER PHAENOTYPEN 85
5
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
IV.3. IN VITRO KOMPLEMENTATION DES GABA A-REZEPTORS AUS MEHREREN
UNTEREINHEITEN 87
KLONIERUNG DIVERSER GABAA-REZEPTOR-VARIANTEN 87
PROTEINEXPRESSIONSSTUDIEN 88
SUBZELLULARE LOKALLSATION DER GABAAR-VARIANTEN 9 1
FUNKTIONALITAET DES INTRINSISCHEN LONENKANALS 95
V. DISKUSSION 9 7
V.1. FUNKTIONELLE IN VITRO KOMPLEMENTATION DES GLYRS AUS UNABHAENGIG
EXPRIMIERTEN DOMAENEN 97
FUNKTIONALITAET UND POTENZIELLE PROTEIN-INTERAKTIONEN DER GLYR-DOMAENEN 98
LADUNGEN ALS VERMITTLER? 100
ORIENTIERUNG INNERHALB DER ZELLMEMBRAN 101
BEDEUTUNG DER TM3-4 SCHLEIFE FUER EINE FUNKTIONELLE KOMPLEMENTATION 102
PROTEIN-INTERAKTIONEN ZWISCHEN DEN GLYR-DOMAENEN 103
ZUSAMMENFASSUNG & AUSBLICK 104
V.2. TRANSGENE MAEUSE - WIEDERHERSTELLUNG DER GLYR-FUNKTION IN VIVO 106
PROTEINEXPRESSION DER TRANSGENEN KONSTRUKTE 107
ZUSAMMENFASSUNG & AUSBLICK 108
V.3. IN VITRO KOMPLEMENTATION DES GABAA-REZEPTORS AUS MEHREREN
UNTEREINHEITEN 108
UNTERSCHIEDE DER GLYRA1-TRC UND GABARY2-TRC KOMPLEMENTATION? 108
KEINE FUNKTIONELLE KOMPLEMENTATION DER GABARY2-UE 109
ZUSAMMENFASSUNG & AUSBLICK 110
V.4. PERSPEKTIVE GENTHERAPIE 111
VI. LITERATUR 1 1 2
VII. ANHANG 1 2 2
VII.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 122
VII.2 AMINOSAEUREN UND DEREN EIGENSCHAFTEN 124
VII.3 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 125
VII.4 TABELLENVERZEICHNIS 126
VII.5 SEQUENZEN 127
GLYR-DOMAENEN 127
PRK7-VEKTOR 129
GABARY2-DOMAENEN 130
VII.6 DANKSAGUNG 133
6
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