Untersuchungen zur Autophagie-abhängigen Präsentation intrazellulärer Antigene auf MHC-Klasse-II:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
1 ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY 1
2 EINLEITUNG 4
2.1 DIE ANGEBORENE UND DIE ADAPTIVE IMMUNABWEHR 4
2.2 CD8+ T-ZELLVERMITTELTE IMMUNABWEHR 4
2.3 CD4+ T-ZELLVERMITTELTE IMMUNABWEHR 5
2.4 DIE ANTIGENPRAESENTATION 6
2.4.1 DIE MHC-MOLEKUELE 6
2.4.2 KLASSISCHE ANTIGENPRAESENTATIONSWEGE 7
2.4.2.1 PRAESENTATION AUF MHC-KLASSE-I-MOLEKUELEN 7
2.4.2.2 PRAESENTATION AUF MHC-KLASSE-IL-MOLEKUELEN 8
2.4.3 ALTERNATIVE ANTIGENPRAESENTATIONSWEGE 10
2.4.3.1 KREUZPRAESENTATION EXTRAZELLULAERER ANTIGENE AUF MHC-KLASSE-I-
MOLEKUELEN 10
2.4.3.2 PRAESENTATION INTRAZELLULAERER ANTIGENE AUF
MHC-KLASSE-IL-MOLEKUELEN 10
2.5 AUTOPHAGIE 10
2.5.1 MAKROAUTOPHAGIE 11
2.5.2 CHAPERON-VERMITTELTE AUTOPHAGIE 13
2.5.3 MIKROAUTOPHAGIE 14
2.5.4 BETEILIGUNG DER AUTOPHAGIE AN DER ANTIGENPRAESENTATION AUF
MHCKLASSE-IL-MOLEKUELEN 14
2.5.5 BETEILIGUNG DER AUTOPHAGIE AN DER ANTIGENPRAESENTATION AUF
MHCKLASSE-I-MOLEKUELEN 17
2.5.6 MAKROAUTOPHAGIE ALS ABWEHRMECHANISMUS GEGEN INTRAZELLULAERE
PATHOGENE 17
2.5.7 DIE MOLEKULARE REGULATION VON AUTOPHAGIE DURCH TOR 19
2.5.8 AUTOPHAGIE UND APOPTOSE 21
2.6 FRAGESTELLUNG 22
3 MATERIALIEN 24
3.1 CHEMIKALIEN 24
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.2 GERAETE 25
3.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN 26
3.4 ALLGEMEINE PUFFER UND LOESUNGEN 27
3.5 ZELLKULTURMEDIEN 27
3.6 ZELLLINIEN 28
3.6.1 LYMPHOBLASTOIDE ZELLLINIEN 28
3.6.2 BURKITT-LYMPHOM ZELLLINIEN 29
3.6.3 ADHAERENT WACHSENDE EPITHELZELLLINIEN 29
3.6.4 T-ZELLEN 29
3.6.4.1 T-ZELLKLONE 29
3.6.4.2 T-ZELLLINIEN ! 30
3.7 BAKTERIENSTAEMME 30
3.8 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE KLONIERUNG VON SHRNAS 30
3.9 PLASMIDE 31
3.10 DNA-MODIFIZIERENDE ENZYME 34
3.11 ANTIKOERPER 34
3.11.1 PRIMAERANTIKOERPER 34
3.11.2 SEKUNDAERANTIKOERPER 35
3.12 ZYTOKINE 35
4 METHODEN 36
4.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 36
4.1.1 ALLGEMEINE ANMERKUNGEN 36
4.1.2 KRYOKONSERVIERUNG UND AUFTAUEN VON ZELLEN 36
4.1.3 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 36
4.1.4 KULTIVIERUNG VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN 37
4.1.4.1 KULTIVIERUNG ADHAERENT WACHSENDER ZELLLINIEN 37
4.1.4.2 KULTIVIERUNG VON SUSPENSIONSZELLEN 37
4.1.4.3 RESTIMULATION UND KULTIVIERUNG VON ETABLIERTEN T-ZELLEN 37
4.1.5 ISOLIERUNG PERIPHERER MONONUKLEARER ZELLEN AUS VOLLBLUT DURCH
FICOLLDICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFUGATION 38
4.1.6 HERSTELLUNG VON VIRUSKONZENTRAT 39
II
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.7 TRANSFEKTION VON HEK293T-ZELLEN MIT POLYETHYLENIMIN 39
4.1.8 TRANSFEKTION VON SUSPENSIONSZELLEN MITTELS ELEKTROPORATION 39
4.1.8.1 TRANSFEKTION VON SUSPENSIONSZELLEN MIT DEM GENEPULSER II VON
BIORAD 39
4.1.8.2 TRANSFEKTION VON SUSPENSIONSZELLEN MITTELS NEON-TECHNOLOGIE
(INVITROGEN) 40
4.1.9 MAGNETISCHE ZELLSEPARATION 40
4.1.10 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 41
4.1.11 ANALYSE DER T-ZELL-ANTIGENERKENNUNG 42
4.1.12 ENZYME-IINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 42
4.1.13 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 43
4.2 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 43
4.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 43
4.3.1 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIEN FUER DIE TRANSFORMATION
VON PLASMID-DNA 43
4.3.2 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN 44
4.3.3 ISOLIERUNG KLEINER MENGEN PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN 44
4.3.4 ISOLIERUNG GROSSER MENGEN PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN 45
4.3.5 DNA-KLONIERUNG 46
4.3.5.1 SCHNEIDEN DER DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 46
4.3.5.2 SYNTHESE VON GLATTEN ENDEN NACH DEM RESTRIKTIONSVERDAU 47
4.3.5.3 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (POLYMERASE CHAIN REACTION, PCR) 47
4.3.5.4 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION 48
4.3.5.5 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 49
4.3.5.6 ISOLIERUNG UND AUFBEREITUNG VON DNA-FRAGMENTEN 49
4.3.5.7 LIGATION ZWEIER DNA-MOLEKUELE 50
4.3.5.8 KLONIERUNG VON SHRNA 50
4.3.5.9 DNA-SEQUENZANALYSE 50
4.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 51
4.4.1 HERSTELLUNG VON RIPA-EXTRAKTEN 51
4.4.2 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 51
4.4.3 COOMASSIE-FAERBUNG 52
III
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
4.4.4 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS VON PROTEINEN 52
4.4.4.1 PROTEIN-T RANSFER (WESTERN-BLOT) 52
4.4.4.2 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS DER PROTEINE 53
5 ERGEBNISSE 55
5.1 ETABLIERUNG EINES TESTSYSTEMS ZUR ZEITLICH GETRENNTEN EXPRESSION
EINES MODELLANTIGENS UND DER MODULATION VON AUTOPHAGIE 55
5.1.1 AUTOPHAGIE-ABHAENGIGE PRAESENTATION DES MODELLANTIGENS NUCNEOR AUF
MHC-KLASSE-IL NACH KONDITIONALER EXPRESSION IN LCL 58
5.1.2 ETABLIERUNG VON EBNA3C ALS MODELLANTIGEN FUER DIE UNTERSUCHUNG DER
ENDOGENEN PRAESENTATION AUF MHC-KLASSE-IL 60
5.2 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES AUTOPHAGIE-ASSOZIIERTER GENE AUF DIE
ENDOGENE PRAESENTATION VON ANTIGENEN AUF MHC-II 62
5.2.1 DER KNOCK-DOWN VON BECLIN-1 IN ANTIGENPRAESENTIERENDEN ZELLEN FUEHRT
NICHT ZU EINER VERRINGERTEN PRAESENTATION VON EBNA3C AUF MHC-KLASSE- IL
62
5.2.2 WEDER DIE UEBEREXPRESSION VON WILDTYP-ATG5 NOCH DIE EXPRESSION
EINER DOMINANT-NEGATIVEN MUTANTE HABEN EINFLUSS AUF DIE PRAESENTATION VON
EBNA3C AUF MHC-KLASSE-IL 67
5.2.3 DIE INHIBIERUNG VON MTORCI ODER MTORC2 FUEHRT NICHT ZU EINER
VERSTAERKTEN ANTIGENPRAESENTATION AUF MHC-KLASSE-IL 71
5.3 DER KNOCK-DOWN VON P62 IN ANTIGENPRAESENTIERENDEN ZELLEN FUEHRT ZU
EINER VERRINGERTEN ANTIGENPRAESENTATION AUF MHC-KLASSE-IL 76
5.4 DIE PRAESENTATION VON ANTIGEN AUF MHC-KLASSE-I VERSUS MHC-KLASSE-IL
WIRD DURCH VERSCHIEDENE UBIQUITIN-MUTANTEN UNTERSCHIEDLICH BEEINFLUSST
82
5.5 DIE PRAESENTATION AUF MHC-KLASSE-IL SETZT KEINE UBIQUITINYLIERUNG DES
ANTIGENS VORAUS 94
5.5.1 DIE IM VERGLEICH ZU NEOR VERBESSERTE PRAESENTATION VON NUCNEOR AUF
MHC-II BERUHT NICHT AUF SEINER NUKLEAEREN LOKALISATION 94
5.5.2 DIE EFFIZIENTE PRAESENTATION VON NUCNEOR AUF MHC-II WIRD NICHT
DURCH LYSINE IN DER NLS VERMITTELT 96
5.5.3 DIE MUTATION UBIQUITINYLIERBARER AMINOSAEUREN IM VIRALEN BZLF1
-PROTEIN FUEHRT NICHT ZU EINER VERMINDERTEN PRAESENTATION AUF
MHC-KLASSE-IL 98
5.5.4 FUER DIE ENDOGENE PRAESENTATION AUF MHC-II SIND KEINE
UBIQUITINYLIERBAREN AMINOSAEUREN IM ANTIGEN NOTWENDIG 100
5.5.5 DIE ENTFERNUNG UBIQUITINYLIERBARER AMINOSAEUREN IM ZELLULAEREN
PROTEIN MART1 VERMINDERT DIE ENDOGENE ANTIGENPRAESENTATION AUF
MHC-KLASSE- IL NICHT 102
6 DISKUSSION 104
IV
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
6.1 ETABLIERUNG EINES KONDITIONALEN TESTSYSTEMS ZUR ZEITLICH GETRENNTEN
EXPRESSION EINES MODELLANTIGENS UND DER MODULATION VON AUTOPHAGIE 104
6.2 DER KNOCK-DOWN VON BECLIN-1 HAT KEINEN EINFLUSS AUF DIE ENDOGENE
PRAESENTATION VON ANTIGENEN AUF MHC-II 104
6.3 DIE EXPRESSION VON ATG5 BZW. DNATG5 HAT KEINEN EINFLUSS AUF DIE
ENDOGENE PRAESENTATION VON ANTIGENEN AUF MHC-II 107
6.4 DIE INHIBIERUNG VON MTORCI ODER MTORC2 FUEHRT NICHT ZU EINER
VERSTAERKTEN ANTIGENPRAESENTATION AUF MHC-KLASSE-IL 108
6.5 DER KNOCK-DOWN VON P62 UND DIE EXPRESSION DER UBIQUITIN-K63RMUTANTE
FUEHREN ZU EINER VERRINGERTEN ANTIGENPRAESENTATION AUF MHCKLASSE-IL 110
6.6 DIE OBERFLAECHENEXPRESSION VON MHC-MOLEKUELEN WIRD DURCH DIE
UEBEREXPRESSION DER UBIQUITIN-MUTANTEN NICHT BEEINFLUSST 112
6.7 DIE PRAESENTATION AUF MHC-KLASSE-IL SETZT KEINE UBIQUITINYLIERUNG DES
ANTIGENS VORAUS 113
6.8 WERDEN DIE MHC-KLASSE-I- UND MHC-KLASSE-IL-PRAESENTATIONSWEGE AUS DEM
GLEICHEN INTRAZELLULAEREN ANTIGENPOOL GESPEIST? 117
6.9 AUSBLICK 119
7 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 120
8 T ABELLENVERZEICHNIS 123
9 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 124
10 LITERATURVERZEICHNIS 127
DANKSAGUNG 140
EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 141
LEBENSLAUF 142
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