Zeitaufgelöste fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen an der cytoplasmatischen Oberfläche von Rhodopsin:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 9
1.1 MOTIVATION 9
1.2 ZIELSETZUNG U N D LOESUNGSANSATZ 11 1.2.1 AUFBAU EINER
2D-TCSPC-APPARATUR Z U R DETEKTION VON PROTEINKONFORMATIONSAENDERUNGEN 11
1.2.2 DYNAMIK AN DER CYTOPLASMATISCHEN OBERFLAECHE VON BAKTERIORHODOPSIN
12 1.2.3 DYNAMIK A N DER CYTOPLASMATISCHEN OBERFLAECHE VON RHODOPSIN U N
D DIE
INTERAKTION MIT SIGNALPROTEINEN 12 2 GRUNDLAGEN 15
2.1 RHODOPSIN - DAS SEHPIGMENT IM AUGE 15 2.1.1 ORGANISATION VON
RHODOPSINMEMBRANEN 16 2.1.2 STRUKTUR DES RHODOPSINS 16 2.1.3
FUNKTIONSZYKLUS DES RHODOPSINS 20 2.1.4 FUNKTIONSZYKLUS DES G-PROTEINS U
N D SIGNALWEITERLEITUNG 22 2.1.5 DEAKTIVIERUNG DER SIGNALKASKADE 24
2.2 BAKTERIORHODOPSIN 24 2.2.1 STRUKTUR DES BAKTERIORHODOPSIN 24 2.2.2
FUNKTIONSZYKLUS DES BAKTERIORHODOPSIN 26
2.3 DYNAMIK VON PROTEINEN 27 2.4 FLUORESZENZLOESCHUNG 29 2.4.1 ,
ENERGIEUEBERTRAGUNGSMECHANISMEN 30 3 MATERIAL U N D METHODEN 33
3.1 ZEITAUFGELOESTE FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE 33 3.1.1 MESSPRINZIP DER
EINZELPHOTONENZAEHLUNGSSPEKTROSKOPIE 33 3.2 TRANSIENTE FLASH -
ABSORPTIONSSPEKTROSKOPIE 35 3.2.1 MESSAUFBAU 35
3.2.2 MESSBEDINGUNGEN 36 3.3 EINZELMOLEKUELEXPERIMENTE 36 3.3.1
MESSPRINZIP DER EINZELMOLEKUELEXPERIMENTE 36
3.3.2 AUFBAU 37
3.4 ZIRKULARDICHROISMUSEXPERIMENTE 38 3.5 FLUORESZENZREPORTERGRUPPEN 40
3.6 PRAEPARATION DER BIOLOGISCHEN PROBEN 42 3.6.1
BAKTERIORHODOPSINPRAEPARATION 42
3.6.2 RHODOPSINPRAEPARATION 42 3.6.3 OPSINPRAEPARATION / PRAEPARATION VON
PHOSPHORYLIERTEM RHODOPSIN 43 3.6.4 TRANSDUCINPEPTIDE 44 3.6.5
ARRESTINPRAEPARATION 44 3.7 AUSWERTUNG DER EXPERIMENTE 44
3.7.1 ANALYSE ZEITAUFGELOESTER FLUORESZENZDATEN 44 3.7.2 ANALYSE DER
EINZELMOLEKUELEXPERIMENTE 55 4 RESULTATE & DISKUSSION TEIL I: AUFBAU
EINER ZEITAUFGELOESTEN FLUORESZENZ PUMP-PROBE APPARATUR 57 4.1
BESCHREIBUNG DER 2D-TCSPC APPARATUR 58
HTTP://D-NB.INFO/1037031563
IMAGE 2
4.2 TESTMESSUNG MIT BAKTERIORHODOPSIN 60
4.3 DISKUSSION 64
5 RESULTATE & DISKUSSION TEIL II: DIE DYNAMIK VON HELIX 8 AN DER
CYTOPLASMATISCHEN SEITE VON RHODOPSIN BEI REZEPTORAK TIVIERUNG 67
5.1 PH-ABHAENGIGKEIT DER FLUORESZENZEIGENSCHAFTEN VON FLUORESCEIN 68
5.1.1 FREIES FLUORESCEIN 68
5.1.2 RHODOPSIN-FLUORESCEIN-KOMPLEX 72
5.2 FLUORESCEIN-FLUORESZENZZERFALLSZEITEN ALS INDIKATOR FUER HELIX 8 -
UMGEBUNGSAENDERUNGEN 75
5.2.1 APOPROTEIN OPSIN 76
5.2.2 RHODOPSIN DISKMEMBRANEN 78
5.2.3 SOLUBILISIERTES RHODOPSIN IN SS-DM MIZELLEN 84
5.2.4 ZUSAMMENFASSENDE ANALYSE DER FLUORESZENZLEBENSDAUERMESSUNGEN ALS
IN DIKATOR FUER HELIX 8 UMGEBUNGSAENDERUNGEN 86
5.3 DIE DYNAMIK DER HELIX 8 VON RHODOPSIN 90
5.3.1 HELIX 8 - DYNAMIK UNTER PHYSIOLOGISCHEN PUFFER-BEDINGUNGEN 91
5.3.2 OPSIN-AF IN NATIVER MEMBRAN 93
5.3.3 ANISOTROPIE DER OPSIN-MIZELLEN 95
5.3.4 ANISOTROPIE DER RHODOPSIN MEMBRANEN BEI 0C 97
5.3.5 ANISOTROPIE DER RHODOPSIN MEMBRANEN BEI 37C 101
5.3.6 ANALYSE D E R HELIX 8 DYNAMIK MITTELS ORDNUNGSPARAMETER P2 ,
P4 U N D DER VERTEILUNGSFUNKTION F (0) 104
5.4 DISKUSSION 107
6 RESULTATE & DISKUSSION TEIL III: RHODOPSINAKTIVIERUNG & INTERAKTION
MIT TRANSDUCIN 109
6.1 OPSIN + P G Y A - LY FLUORESZENZMESSUNGEN 115
6.2 ZEITAUFGELOESTE FLUORESZENZZERFALLSAENDERUNGEN WAEHREND DER BINDUNG DES
P G J OT - LY AN DAS LICHTAKTIVIERTE RHODOPSIN 117
6.2.1 ZEITAUFGELOESTE MESSUNG DER BINDUNG VON P G J A - LY 117
6.3 EINFLUSS DES PGYA-PEPTIDES AUF DIE HELIX 8 DYNAMIK 123
6.4 VERFOLGUNG D E R BINDUNG VON G J A - P E P T I D E N A N DER
OBERFLAECHE VON DISKMEMBRA NEN 126
6.5 DISKUSSION 130
7 RESULTATE & DISKUSSION TEIL IV: RHODOPSINDEAKTIVIERUNG & INTERAKTION
MIT ARRESTIN 133
7.1 ANISOTROPIE VON HELIX 8 133
7.2 DISKUSSION 137 8 ZUSAMMENFASSUNG 139 PUBLIKATIONSLISTE 143
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 145
LITERATURVERZEICHNIS 147 SELBSTSTAENDIGKEITSERKLAERUNG 161 DANKSAGUNG 163
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