alpha-MSH-induzierte anorexigene Signalwege in murinen Hypothalamuszellen:
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
2 SUMMARY 3
3 EINLEITUNG 4
3.1 ADIPOSITAS 4
3.2 ENERGIEHOMDOSTASE IN DER PERIPHERIE 6
3.3 ENERGIEHOMOOSTASE IM HYPOTHALAMUS 9
3.3.1 PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG DES MC4R 11
3.4 G-PROTEIN GEKOPPELTE REZEPTOREN 13
3.4.1 SIGNALWEGE VON G-PROTEIN GEKOPPELTEN REZEPTOREN 15
3.5 DIE FAMILIE DER MELANOCORTIN-REZEPTOREN 17
3.6 DER MELANOCORTIN-4-REZEPTOR 20
3.6.1 EXPRESSIONSPROFIL DES MC4R 20
3.6.2 AGONISTEN DES MC4R 21
3.6.3 MC4R-INDUZIERTE SIGNALWEGE 22
3.6.3.1 MC4R-EFFEKTOREN IN VIVO 22
3.6.3.2 MC4R-EFFEKTOREN IN VITRO 23
3.7 MAPK-KASKADE 26
3.7.1 ALLGEMEIN 26
3.7.2 GPCR-VERMITTELTE AKTIVIERUNG VON ERK-1/2 28
3.8 AMPK 31
3.8.1 AMPK ALS ENERGIESENSOR 31
3.8.2 AMPK IN DER PERIPHERIE 32
3.8.3 AMPK IM HYPOTHALAMUS 33
3.8.4 STRUKTUR DER AMPK 35
3.8.5 REGULATION DER AMPK DURCH PHOSPHORYLIERUNG 36
3.8.6 REGULATION DER AMPK DURCH AMPK-KINASEN 37
3.9 ERK-1/2 UND AMPK INTERAKTION 38
3.10 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 40
4 MATERIAL UND METHODEN 41
4.1 MATERIAL 41
4.1.1 GERATE 41
4.1.2 VERBAUCHSMATERIALIEN 42
4.1.3 REAGENZIEN 42
HTTP://D-NB.INFO/1035677202
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.4 ANTIKORPER 43
4.1.4.1 PRIMARANTIKDRPER 43
4.1.4.2 SEKUNDARANTIKORPER (MEERRETTICH-PEROXIDASE KONJUGIERT) 43 4.1.5
SIRNAS 44
4.1.6 ZELLEN UND NAHRMEDIEN 44
4.1.7 BAKTERIEN 44
4.1.8 PLASMIDE 44
4.2 METHODEN 45
4.2.1 ZELLKULTUR 45
4.2.1.1 KULTIVIERUNG VON GT1-7 ZELLEN 45
4.2.1.2 TRANSFEKTION 46
4.2.1.3 KONSERVIERUNG IN FLASSIGEM STICKSTOFF 46
4.2.1.4 AUFTAUEN VON GT1-7 ZELLEN 47
4.2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 47
4.2.2.1 HERSTELLUNG VON KOMPETENTEN BAKTERIEN 47
4.2.2.2 TRANSFORMATION KOMPETENTER E. CO/I-BAKTERIEN DURCH HITZESCHOCK
48 4.2.2.3 QUANTITATIVE ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 49
4.2.3 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 49
4.2.3.1 BESTIMMUNG INTRAZELLULFLRER CALCIUM-IONEN-KONZENTRATIONEN
MITTELS FURA-2 49
4.2.3.2 CAMP-AKKUMULATIONSVERSUCH 51
4.2.3.3 VORBEREITUNG DER PROTEINPROBEN FLLR DIE GELELEKTROPHORESE 52
4.2.3.4 POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE 54
4.2.3.5 WESTERN BLOT 55
4.2.3.6 REPORTERGEN-STUDIEN 59
4.2.3.7 ELEKTROPORATION VON SIRNAS 60
4.2.3.8 PEPCHIP KINASE-ARRAY 62
4.2.4 STATISTISCHE METHODEN 66
5 ERGEBNISSE 67
5.1 FUNKTIONELLER NACHWEIS DES MC4R IN GT1-7 ZELLEN 67
5.2 EXPERIMENTE MIT SERUMENTZUG 70
5.2.1 ERK- 1/2-REGULATION 70
5.2.1.1 A-MSH-VERMITTELTE ERK-1/2 PHOSPHORYLIERUNG 70
5.2.1.2 ABHSNGIGKEIT DER A-MSH-INDUZIERTEN ERK-1/2 PHOSPHORYLIERUNG VON
CALCIUM-IONEN UND PKC 74
5.2.1.3 ABHANGIGKEIT DER A-MSH-INDUZIERTEN ERK-1/2 PHOSPHORYLIERUNG VON
/TX-SENSITIVEN G-PROTEINEN -76
5.2.1.4 ABHANGIGKEIT DER A-MSH-INDUZIERTEN ERK-1/2 PHOSPHORYLIERUNG VON
PKA 79
5.2.1.5 REPORTERGEN-STUDIEN IN GT1-7 ZELLEN 83
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.2 AMPK-REGULATION 85
5.2.2.1 A-MSH-VERMITTELTE AMPK-REGULATION 85
5.2.2.2 ABHANGIGKEIT DER A-MSH-INDUZIERTEN AMPK DEPHOSPHORYLIERUNG VON
PKC 86
5.2.2.3 ABHANGIGKEIT DER A-MSH-INDUZIERTEN AMPK DEPHOSPHORYLIERUNG VON
PTX-SENSITIVEN G-PROTEINEN 88
5.2.2.4 ABHANGIGKEIT DER A-MSH-INDUZIERTEN AMPK DEPHOSPHORYLIERUNG VON
PKA 89
5.2.2.5 ABHANGIGKEIT DER A-MSH-INDUZIERTEN AMPK DEPHOSPHORYLIERUNG VON
MEK-1/2 91
5.2.2.6 ABHANGIGKEIT DER A-MSH-INDUZIERTEN AMPK DEPHOSPHORYLIERUNG VON
AMPK-KINASEN 94
5.2.2.7 REGULATION DER LKB1 EXPRESSION DURCH SIRNAS 99
5.2.3 ZUSAMMENFASSUNG 105
5.3 EXPERIMENTE OHNE SERUMENTZUG 107
5.3.1 REGULATION DER AMPK DURCH A-MSH 108
5.3.2 ABHANGIGKEIT DER A-MSH-VERMITTELTEN AMPK-REGULATION VON ERK-1/2
..110 5.3.3 PKA-ABHSNGIGKEIT DER A-MSH-INDUZIERTEN AMPK
DEPHOSPHORYLIERUNG. 113 5.3.4 ABHANGIGKEIT DER A-MSH-INDUZIERTEN AMPK
DEPHOSPHORYLIERUNG VON AMPK-KINASEN 115
5.3.5 ZUSAMMENFASSUNG 118
5.3.6 PEPCHIP 119
6 DISKUSSION 126
6.1 A-MSH-INDUZIERTE SIGNALWEGE NACH SERUMENTZUG 126
6.1.1 PKA-ABH3NGIGKEIT DER ERK-L/2-REGULATION 128
6.1.2 PKA-ABHANGIGKEIT DER AMPK-REGULATION 129
6.1.3 ERK- 1/2-ABHANGIGKEIT DER AMPK-REGULATION 130
6.1.4 DIE LKB1 ALS AMPKK 131
6.1.5 VERGLEICH MIT IN VIVO BEFIINDEN 134
6.2 A-MSH-INDUZIERTE SIGNALWEGE UNTER SERUMHALTIGEN BEDINGUNGEN 135
6.2.1 PEPCHIP-ANALYSE 137
6.3 VERGLEICH DER SIGNALWEGE UNTER BEIDEN BEDINGUNGEN 144
6.4 AUSBLICK 147
7 LITERATURVERZEICHNIS 150
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
8 ANHANG I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS I
TABELLENVERZEICHNIS V
ABKURZUNGSVERZEICHNIS VI
AMINOSAURENVERZEICHNIS X
PEPCHIP XI
DANKSAGUNG XIII
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