Untersuchungen zur Rolle von beta2-Syntrophin in Adipozyten:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS VI
1 EINLEITUNG 1
1.1 ENTWICKLUNG UND AUFBAU DES FETTGEWEBES 1
1.1.1 MESENCHYMALE STAMMZELLEN ALS VORLAEUFERZELLEN . 1
1.1.2 ADIPOGENESE 2
1.1.3 LIPIDTROPFEN 4
1.1.3.1 CAVEOLIN-1 4
1.1.3.2 PERILIPIN 5
1.1.4 LIPOLYSE 5
1.2 DAS FETTGEWEBE 6
1.2.1 FORMEN DES FETTGEWEBES 6
1.2.2 METABOLISCHE UND ENDOKRINE ROLLE DES FETTGEWEBES 7
1.2.3 PATHOPHYSIOLOGISCHE VERAENDERUNGEN DES FETTGEWEBES - ADIPOSITAS 7
1.3 BETA2-SYNTROPHIN 8
1.3.1 STRUKTUR UND FUNKTIONEN DER SYNTROPHINE 8
1.4 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 10
2 MATERIAL UND METHODEN 12
2.1 MATERIAL 12
2.1.1 GERAETE 12
2.1.2 V ERBRAUCHSMATERIALIEN 13
2.1.3 CHEMIKALIEN 14
2.1.4 KIT-SYSTEME 17
2.1.5 ANTIKOERPER 18
2.1.5.1 PRIMAERE ANTIKOERPER 18
2.1.5.2 SEKUNDAERE ANTIKOERPER 19
2.1.6 OLIGONUKLEOTIDE 19
2.1.6.1 OLIGONUKLEOTIDE ZUR AMPLIFIZIERUNG MURINER GENE 19
2.1.7 SIRNAS 20
2.1.8 PUFFER UND LOESUNGEN 21
2.1.8.1 LOESUNGEN FUER ARBEITEN MIT DNA 21
2.1.8.2 LOESUNGEN FUER ARBEITEN MIT PROTEINEN 22
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
II
2.1.8.2.1 LOESUNGEN FUER DIE PRAEPARATION VON PROTEINEXTRAKTEN 22
2.1.8.2.2 LOESUNGEN FUER SDS-PAGE 23
2.1.8.2.3 LOESUNGEN FUER WESTERN-BLOTTING 24
2.1.8.2.4 ANTIKOERPERLOESUNGEN 25
2.1.8.2.5 LOESUNGEN FUER ELISAS * 25
2.1.8.2.6 LOESUNGEN ZUR SILBERFARBUNG VON ACRYLAMIDGELEN 26
2.1.8.3 LOESUNGEN FUER OIL RED O FAERBUNG 27
2.1.8.4 LOESUNGEN FUER IMMUNFLUORESZENZFARBUNG 27
2.1.8.5 LOESUNGEN FUER IMMUNHISTOCHEMIEFARBUNG 28
2.1.8.6 PUFFER ZUR ADIPOZYTENISOLIERUNG 29
2.1.8.7 LOESUNGEN FUER FETTSAEURESTIMULATIONEN 29
2.1.9 MEDIEN FUER MURINE FIBROBLASTENZELLEN 30
2.1.9.1 KULTIVIERUNGSMEDIUM 30
2.1.9.2 DIFFERENZIERUNGSMEDIUM 31
2.1.10 MEDIEN FUER PRIMAERE ADIPOZYTEN 31
2.1.10.1 KULTIVIERUNGSMEDIUM 31
2.1.10.2 DIFFERENZIERUNGSMEDIUM 32
2.1.11 ORGANISMEN 32
2.2 METHODEN 33
2.2.1 KULTIVIERUNG VON ZELLEN 33
2.2.1.1 KULTIVIERUNG DER FIBROBLASTENZELLLINIE 3T3-LI 33
2.2.1.2 DIFFERENZIERUNG VON 3T3-L1 FIBROBLASTEN ZU ADIPOZYTEN 33
2.2.1.3 DIFFERENZIERUNG VON PRIMAEREN HUMANEN ADIPOZYTEN 34
2.2.1.4 RNA-INTERFERENZ 34
2.2.1.4.1 TRANSFEKTION DER PRAEADIPOZYTEN 34
2.2.1.4.2 TRANSFEKTION REIFER ADIPOZYTEN 35
2.2.1.5 STIMULATIONSVERSUCHE 36
2.2.1.5.1 INKUBATION MIT FETTSAEUREN 36
2.2.1.5.2 STIMULATION MIT EPINEPHRIN 36
2.2.1.5.3 CHOLESTERINDEPLETION 36
2.2.1.6 BESTIMMUNG DES ZELLTODES 37
2.2.1.6.1 ZYTOTOXIZITAET 37
2.2.1.6.2 APOPTOSE 37
2.2.1.7 BESTIMMUNG DER VIABILITAET 37
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.2.1.7.1 AUSZAEHLUNG DER VITALEN ZELLEN 37
2.2.1.7.2 CTB ZELLVIABILITAETSASSAY 38
2.2.2 ARBEITEN MIT DNA 38
2.2.2.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA 38
2.2.2.2 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 38
2.2.2.3 REAL-TIME PCR 39
2.2.2.4 AUFREINIGUNG UND SEQUENZIERUNG VON DNA 40
2.2.3 ARBEITEN MIT RNA 41
2.2.3.1 ISOLIERUNG VON RNA AUS ZELLEN UND GEWEBEN 41
2.2.3.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON RNA 41
2.2.3.3 REVERSE TRANSKRIPTION 41
2.2.4 ARBEITEN MIT PROTEINEN 42
2.2.4.1 PRAEPARATION VON GESAMTZELLEXTRAKTEN 42
2.2.4.2 PRAEPARATION VON FETTGEWEBSEXTRAKTEN 42
2.2.4.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN 43
2.2.4.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 43
2.2.4.5 COOMASSIE-FAERBUNG 44
2.2.4.6 SILBER-FAERBUNG 44
2.2.4.7 WESTERN-BLOTTING 44.
2.2.4.8 ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 45
2.2.4.8.1 CAMP ELISA 46
2.2.5 OIL RED O FAERBUNG 46
2.2.6 IMMUNFLUORESZENZ 46
2.2.7 HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 47
2.2.7.1 HAEMALAUN-EOSIN-FAERBUNG 47
2.2.7.2 SIRIUS-RED-FAERBUNG 47
2.2.7.3 IMMUNHISTOCHEMIE 48
2.2.8 BESTIMMUNG VON TRIGLYZERIDEN IN SEREN UND ZELL- UND GEWEBSLYSATEN
49
2.2.9 BESTIMMUNG VON CHOLESTERIN IN SEREN UND ZELL- UND GEWEBSLYSATEN 49
2.2.10 BESTIMMUNG VON FREIEN FETTSAEUREN IN SEREN UND ZELLUEBERSTAENDEN 49
2.2.11 BESTIMMUNG VON FREIEM GLYZERIN IN SEREN UND ZELLUEBERSTAENDEN 50
2.2.12 BESTIMMUNG VON GLUKOSE IN SEREN 50
2.2.13 KOIMMUNPRAEZIPITATION 50
2.2.14 ADIPOZYTENISOLIERUNG 51
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
IV
2.2.15 FETTGEWEBSKULTUREN 51
2.2.16 TIERMODELLE 51
2.2.16.1 SYNTROPHIN KNOCK-OUT MAEUSE 52
2.2.16.2 INTRAPERITONEALER GLUKOSE-UND INSULINTOLERANZTEST 52
2.2.16.3 INTRAPERITONEALER INSULININJEKTION * 52
2.2.16.4 POSTPRANDIALE UNTERSUCHUNGEN 52
2.2.16.5 OB/OB MAEUSE . 53
2.2.16.6 WILDTYP C57BL/6 MAEUSE 53
2.2.17 QUANTIFIZIERUNG DER IMMUNOBLOTEXPERIMENTE 53
2.2.18 STATISTISCHE AUSWERTUNGEN 53
3 ERGEBNISSE 55
3.1 SNTB2 EXPRESSION IN MURINEN ADIPOZYTEN 55
3.2 EXPRESSION UND FUNKTION VON SNTB2 IN 3T3-L1 ZELLEN 56
3.2.1 LOKALISATION VON SNTB2 IN 3T3-LI FIBROBLASTEN 57
3.2.2 FUNKTION VON SNTB2 3T3-L1 FIBROBLASTEN 59
3.2.3 LOKALISATION UND FUNKTION VON SNTB2 IN 3T3-L1 ADIPOZYTEN 61
3.3 SNTB2 KNOCKDOWN IN PRIMAEREN HUMANEN ADIPOZYTEN 62
3.4 MORPHOLOGIE DER ZELLEN - AUSBILDUNG GROSSER LIPIDTROPFEN 63
3.4.1 FAS KNOCKDOWN 63
3.4.2 CHOLESTERINDEPLETION 65
3.4.3 SREBP2 KNOCKDOWN 68
3.5 SPEICHERUNG VON FREIEN FETTSAEUREN UND LIPOLYSE 69
3.5.1 KNOCKDOWN VON SNTB2 WAEHREND DER ADIPOGENESE 69
3.5.2 KNOCKDOWN VON SNTB2 IN REIFEN ZELLEN 72
3.6 IDENTIFIZIERUNG VON INTERAKTIONSPARTNERN 74
3.6.1 UTROPHIN KNOCKDOWN 74
3.6.2 CAVEOLIN-1 KNOCKDOWN 76
3.7 METABOLISCHE CHARAKTERISIERUNG DER SNTB2 DEFIZIENTEN MAEUSE 79
3.7.1 GEWICHT UND SERUMPARAMETER 79
3.7.2 INSULINWIRKUNG UND GLUKOSETOLERANZ 81
3.7.3 ANALYSE DER FETTDEPOTS 84
3.7.3.1 MORPHOLOGIE DER FETTDEPOTS 84
3.7.3.2 LIPIDSPEICHERUNG UND -FREISETZUNG 87
3.7.3.2.1 GESPEICHERTER LIPIDGEHALT 87
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
V
3.7.3.2.2 LIPOGENE ENZYME UND LIPASEN 88
3.7.3.2.3 CHOLESTERINVERTEILUNG 91
3.7.3.3 ENTZUENDUNGSREAKTION IM FETTGEWEBE 94
3.7.4 VERAENDERUNGEN IN DER LEBER 96
3.7.4.1 GESPEICHERTE LIPIDE 96
3.7.4.2 CHOLERSTERINVERTEILUNG IN DER LEBER 97
3.7.4.3 GLUKONEOGENESE, FETTSAEURESYNTHESE UND GLUKOSEAUSSIAHME 100
3.7.4.4 ENTZUENDUNG UND FIBROSE IN DER LEBER 101
3.8 OB/OB MAEUSEN 102
3.8.1 GEWICHTSUNTERSCHIEDE UND SERUMPARAMETER 102
3.8.2 IM FETTGEWEBE GESPEICHERTE LIPIDE 103
3.8.3 SNTB2 UND CAVEOLIN-1 IM FETTGEWEBE 104
3.8.4 ANALYSE DER LEBERN DER OB/OB MAEUSE 107
4 DISKUSSION 110
4.1 EXPRESSION UND LOKALISATION VON SNTB2 IN FIBROBLASTEN UND ADIPOZYTEN
110
4.2 DIE ROLLE VON SNTB2 FUER DIE FUNKTIONALITAET VON ADIPOZYTEN 112
4.2.1 ADIPOZYTENHYPERTROPHIE UND HYPERPLASIE 112
4.2.2 METABOLISCHE KONSEQUENZEN DER ADIPOZYTENHYPERTROPHIE 112
4.2.3 REGULATION DER CHOLESTERINHOMEOSTASE 114
4.2.4 SNTB2 BEEINFLUSST DIE ADIPOGENESE 115
4.3 IDENTIFIZIERUNG POTENTIELLER INTERAKTIONSPARTNER VON SNTB2 117
4.3.1 KOMLPEXBILDUNG MIT UTROPHIN 118
4.3.2 CAVEOLIN-1 ALS NEUER INTERAKTIONSPARTNER VON SNTB2 IN ADIPOZYTEN
119
4.3.2.1 CAVEOLIN-1 IN DEN LEBERN DER SNTB2-/-TIERE 120
4.4 SNTB2 IN DER OB/OB MAUS 121
5 ZUSAMMENFASSUNG 123
6 PUBLIKATIONEN UND KONGRESSBEITRAEGE 125
6.1 PUBLIKATIONEN 125
6.1.1 ERSTAUTORENSCHAFTEN 125
6.1.2 KOAUTORENSCHAFTEN 126
6.2 KONGRESSBEITRAEGE 128
6.2.1 VORTRAEGE 128
6.2.2 POSTER 129
7 LITERATURVERZEICHNIS 132
|
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