Untersuchungen zur Eignung von plasmidtransfizierten antigenpräsentierenden Zellen zur Reaktivierung tuberkulosespezifischer T-Helferzellen:
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INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS IV
TABELLENVERZEICHNIS VI
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS VII
1. EINLEITUNG 1
1.1. MOEGLICHKEITEN UND GRENZEN AKTUELLER VERFAHREN ZUR DIAGNOSTIK VON
INFEKTIONEN MIT MYCOBACTERIUM LUBERCULOSIS 2
1.2. DAS HUMANE IMMUNSYSTEM 3
1.3. ENTSTEHUNG VON NAIVEN T-LYMPHOZYTEN 4
1.4. AKTIVIERUNG VON NAIVEN T-HELFERZELLEN ZU EFFEKTORZELLEN 5
1.5. ANTIGENPRAESENTATION DURCH PROFESSIONELLE A P C UND ERKENNUNG VON
FREMDPROTEIN DURCH T-LYMPHOZYTEN 7
1.6. T-ZELL-INDUZIERTE REIFUNGSPROZESSE IN ANTIGENPRAESENTIERENDEN ZELLEN
(APC.) 10
1.7. BEDEUTUNG VON 4.1 BBL UND OX40L FUER DIE IMMUNANTWORT I I
1.8. AKTUELLE METHODEN DER T-ZELL-DIAGNOSTIK 12
1.9. DAS REVERSE SIGNALLING VON TH-ZELLEN: EIN INNOVATIVER ANSATZ ZUR
BESTIMMUNG ERREGERSPEZIFISCHER AKTIVIERTER T-ZELLEN 13
1.10. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 14
2. MATERIAL UND METHODEN 16
2.1. MATERIAL 16
2.1.1. GERAETE UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 16
2.1.2. CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 17
2.1.3. NAEHRMEDIEN UND PUFFER 19
2.1.4. BAKTERIEN UND ZELLEN 21
2.1.5. NUKLEINSAEUREN 22
2.1.5.1. PLASMIDE 22
2.1.5.2. OLIGONUKLEOTIDE 24
2.1.6. ENZYME 24
2.1.7. REKOMBINANTE PROTEINE 24
2.1.8. VERWENDETE KOMMERZIELL ERHAELTLICHE KITS 2 4
2.1.9. ANTIKOERPER 2 5
2.1.10. COMPUTERPROGRAMME 2 5
2.2. METHODEN 26
2.2.1. ARBEITEN MIT BAKTERIEN 26
2.2.1.1. KULTIVIERUNG UND LAGERUNG VON BAKTERIEN 26
2.2.1.1.1. FLUESSIGKULTUREN 26
2.2.1.1.2. PLATTENKULTUREN 26
2.2.1.1.3. GLYCERINKULTUREN 26
2.2.1.2. TRANSFORMATION VON D N A IN BAKTERIENZELLEN 26
2.2.2. ARBEITEN MIT D N A 2 7
2.2.2.1. PRAEPARATION VON PLASMID-DNA MIT ALKALISCHER SCHNELLLYSE 2 7
2.2.2.2. PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PLASMID-DNA 2 7
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IMAGE 2
I L
2.2.2.3. PCR ANALYSE 2 7
2.2.2.4. AGAROSE- GELELEKTROPHORESE 2 8
2.2.2.5. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 29
2.2.2.6. VERDAU VON D N A MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 29
2.2.2.7. LIGATION VON DNA FRAGMENTEN 29
2.2.2.8. PCR VERFAHREN ZUR CHARAKTERISIERUNG REKOMBINANTER
BAKTERIENKLONE 3 0
2.2.3. ARBEITEN MIT ZELLEN 3 0
2.2.3.1. BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 3 0
2.2.3.2. ARBEITEN MIT DG75-ZELLEN 3 0
2.2.3.2.1. AUFTAUEN VON DG75-ZELLEN 3 0
2.2.3.2.2. KULTIVIERUNG VON DG75-ZELLEN 3 1
2.2.3.3. ARBEITEN MIT HUMANEN PBMC (MONONUKLEAERE, PERIPHERE BLUTZELLEN)
31 2.2.3.3.1. ISOLIERUNG VON PBMC AUS VOLLBLUT 31
2.2.3.3.2. KULTIVIERUNG VON PBMC 31
2.2.3.4. ISOLIERUNG VON ZELLPOPULATIONEN AUS PBMC MIT DER MACS
TECHNOLOGIE 3 1
2.2.3.4.1. ISOLIERUNG VON C D 19 + B-ZELLEN 32
2.2.3.4.2. ISOLIERUNG VON CD4 + T - Z E L L E N 32
2.2.3.4.3. ISOLIERUNG VON CD14 + M O N O Z Y T E N 3 3
2.2.3.5. DIFFERENZIERUNG VON MONOZYTEN ZU UNREIFEN UND REIFEN
DENDRITISCHEN ZELLEN UND BELADUNG MIT ESAT-6/ CFP-10 3 3
2.2.3.6. EXPANSION ESAT-6/ CFP-10 SPEZIFISCHER CD4 + T-ZELLEN 3 3
2.2.3.7. RESTIMULATION ESAT-6/ CFP-10 SPEZIFISCHER C D 4 + T-ZELLEN 3 4
2.2.3.8. STIMULATION VON VOLLBLUT MIT REKOMBINANTEM ESAT-6/CFP-10
PROTEIN 3 4
2.2.3.9. TRANSFEKTION MIT DER NUCLEOFECTOR TECHNOLOGIE 3 5
2.2.4. BIOCHEMISCHE METHODEN 35
2.2.4.1. VORBEREITUNG UND DURCHFUHRUNG DER SDS-PAGE
(NATRIUM-DODECYLSULFATPOLYACRY 1 AM ID-GE LEL EKTROPHORESE ) 3 5
2.2.4.1.1. HERSTELLUNG DER POLYACRYLAMIDGELE 3 5
2.2.4.1.2. AUFBEREITUNG VON ZELLEN UND UEBERSTAENDEN 36
2.2.4.1.3. AUFTRENNUNG VON PROTEINEN MIT DER SDS-PAGE 36
2.2.4.2. WESTERN BLOT ANALYSE 3 7
2.2.4.2.1. TRANSFER VON PROTEINEN IM SEMI-DRY-BLOT VERFAHREN 37
2.2.4.2.2. TRANSFER VON PROTEINEN IM WET-BLOT VERFAHREN 37
2.2.4.2.3. NACHWEIS SPEZIFISCHER PROTEINE MITTELS IMMUNOBLOTTING 37
2.2.5. IMMUNOLOGISCHE METHODEN 3 8
2.2.5.1. DURCHFLUSSZYTOMETRIE 3 8
2.2.5.2. FAERBUNG VON OBERFLAECHENMARKERN 38
2.2.5.3. INTRAZELLULAERES FAERBEN VON MARKERN 3 9
2.2.5.4. FAERBEN IN VOLLBLUT 3 9
2.2.5.5. FAERBEN VON ZELLEN MIT PROPIDIUMJODID 3 9
3. ERGEBNISSE 4 1
3.1. T-ZELL INDUZIERTE REIFUNGSPROZESSE IN ANTIGENPRAESENTIERENDEN ZELLEN
(APC) ALS MARKER FUER AKUTE INFEKTIONSERKRANKUNGEN 41
3.2. VERGLEICHENDE TESTUNG VERSCHIEDENER METHODEN ZUR ANTIGENBELADUNG
VON
IMAGE 3
I I I
APC 4 2
3.2.1. ETABLIERUNG EINES VERFAHRENS ZUR ANTIGENBELADUNG DURCH
TRANSFEKTION MIT EXPRESSIONSPLASMIDEN 4 3
3.2.1.1. TRANSFEKTIONSRATEN VON PBMC UND B-ZELLEN IN P B M C 4 5
3.2.1.2. TRANSFEKTIONSRATEN VON T-ZELLEN IN PBMC, B-ZELLEN IN PBMC UND
GESAMTPBMC 4 8
3.2.1.3. VITALITAET VON PBMC-POPULATIONEN BEI VERWENDUNG DES
T RANSFEKTIONSVERFAHRENS 5 0
3.2.1.4. TRANSFEKTIONSRATEN VON B-ZELLEN IN PBMC, ABHAENGIG VON DEREN
ANTEIL IM SPENDERBLUT 52
3.2.1.5. TRANSFEKTIONSRATEN VON ISOLIERTEN B-ZELLEN 5 3
3.2.2. HERSTELLUNG VON EXPRESSIONSVEKTOREN ZUR PRAESENTATION
INTRAZELLULAER
EXPRIMIERTER PROTEINE AUF HLA-KLASSE-II MOLEKUELEN 55
3.2.3. FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DES TRANSFEKTIONSSYSTEMS 58
3.2.3.1. PROTEINEXPRESSION IN PBMC 5 8
3.2.3.2. PROTEINEXPRESSION IN DG75-ZELLEN 60
3.2.3.3. VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNG DER ZELLVITALITAET VOR UND NACH
TRANSFEKTION MIT VERSCHIEDENEN PLASMIDEN UNTER VERWENDUNG DES
NUCLEOFECTOR 9 VERFAHRENS 61
3.2.3.4. STIMULATION VON T-HELFERZELLEN NACH TRANSFEKTION MIT ESAT-6-
BZW. ESAT6/CFP-10-EXPRESSIONSPLASMID IN PBMC UNTER VERWENDUNG DES HUMAN
B CELL NUCLEOFECTOR KITS 6 3
3.2.4. ETABLIERUNG EINES ZELLKULTURMODELLS ZUR OPTIMIERUNG DES
NACHWEISES ANTIGENSPEZIFISCHER T-HELFERZELLEN 64
3.2.4.1. EXPANSION VON ESAT-6/ CFP-10-SPEZIFISCHEN T-HELFERZELLEN 64
3.2.4.2. RESTIMULATION SPEZIFISCHER T-HELFERZELLEN DURCH PROTEINBELADENE
BZW. MIT EXPRESSIONSPLASMID TRANSFIZIERTE A P C 6 5
3.2.5. PROTEINBELADUNG DER A P C IN VOLLBLUT 6 7
4. DISKUSSION 6 9
4.1. EIGNUNG DES NUCLEOFECTOR VERFAHRENS ZUR PLASMIDTRANSFEKTION IN
PRIMAERE B-ZELLEN 69
4.1.1. ANALYSE VON TRANSFEKTIONSRATEN ANHAND DER EXPRESSIONSEFFIZIENZ
VON GFP IN PBMC UND DEREN SUBPOPULATIONEN NACH VERWENDUNG DES
NUCLEOFECTOR VERFAHRENS 70
4.1.2. ANALYSE DER VITALITAET UND GFP-EXPRESSION VON PBMC UND IHREN
SUBPOPULATIONEN BEI ANWENDUNG VERSCHIEDENER TRANSFEKTIONSPROGRAMME DES
NUCLEOFECTOR 71
4.1.3. VERSUCHE ZUR ANALYSE UND OPTIMIERUNG DER TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
UND PROTEINEXPRESSION IN HUMANEN B-ZELLEN 73
4.2. HERSTELLUNG VON ESAT-6 RESPEKTIVE ESAT-6/CFP-10
EXPRESSIONSPLASMIDEN 74
4.3. EXPRESSION VON ESAT-6 IN HUMANEN ZELLEN 75
4.4. UNTERSUCHUNG VON ESAT-6-SPEZIFISCHEN ZELLANTWORTEN 76
ZUSAMMENFASSUNG 79
LITERATURVERZEICHNIS 81
ANHANG 91
DANKSAGUNG 9 4
ERKLAERUNG ZUM PROMOTIONSVERFAHREN 95
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