Molekulare Mechanismen der Retinadegeneration: Aufklärung der erblichen Retinadegenerationen Sorsby Fundusdystrophie und Retinitis Pigmentosa (RP28) - Pathomechanismus und Funktion der beteiligten Proteine
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 AUFBAU DER SAEUGETIERNETZHAUT 1
1.1.1 UEBERBLICK 1
1.1.2 AUFBAU UND FUNKTION DER MAKULA 3
1.1.3 AUFBAU UND FUNKTION DES RPES UND DER BM 4
1.1.4 AUFBAU UND FUNKTION DER PHOTOREZEPTOREN 5
1.2 ERBLICHE ERKRANKUNGEN DER NETZHAUT 7
1.2.1 UEBERBLICK 7
1.2.2 SORSBY FUNDUSDYSTROPHIE (SFD) 7
1.2.3 RETINITIS PIGMENTOSA 12
1.2.3.1 UEBERBLICK 12
1.2.3.2 PATHOPHYSIOLOGIE, KLINISCHES BILD, SYMPTOME 13
1.2.3.3 DIAGNOSE UND BEFUND 13
1.2.3.4 THERAPIEMOEGLICHKEITEN 14
1.2.3.5 AUFKLAERUNG DES RP28-ASSOZIIERTEN GENDEFEKTS 14
1.2.3.6 KLINISCHE CHARAKTERISIERUNG DER PATIENTEN MIT FAM161A
-MUTATIONEN 16 1.2.3.7 DAS RETINITIS PIGMENTOSA PROTEIN FAM161A 16
2 ZIELE DER ARBEIT 21
3 MATERIAL 23
3.1 CHEMIKALIEN 23
3.2 KIT- UND REAKTIONSSYSTEME 24
3.3 BEADS 25
3.4 ENZYME 25
3.5 VEKTOREN 26
3.6 CDNA-KLONE UND PLASMIDE 26
3.7 ANTIKOERPER 26
3.8 MOLEKULARMASSENSTANDARDS 27
3.9 OLIGONUKLEOTIDE 28
3.10 PUFFER UND LOESUNGEN 31
3.11 KULTUR- UND EINFRIERMEDIEN 33
3.12 ZELLLINIEN UND BAKTERIENSTAEMME 34
3.13 MAUSLINIEN 34
3.14 VERBRAUCHSMATERIALIEN 35
3.15 GLASWAREN 36
3.16 GERAETE UND SOFTWARE 36
4 METHODEN 38
4.1 STERILISATION VON MEDIEN UND MATERIALEN 38
4.2 KULTIVIERUNG UND MANIPULATION VON SAEUGETIERZELLEN 38
4.2.1 VERWENDETE ZELLLINIEN 38
4.2.2 ALLGEMEINE WACHSTUMSBEDINGUNGEN 39
4.2.3 WEITERZUCHT KONFLUENTER ZELLEN 39
4.2.4 ERMITTLUNG DER ZELLZAHL VON ZELLSUSPENSIONEN 40
4.2.5 KRYOKONSERVIERUNG UND AUFTAUEN VON SAEUGETIERZELLEN 40
4.2.6 TRANSIENTE TRANSFEKTION 41
4.2.7 HERSTELLUNG VON ZELLLYSATEN 42
4.2.8 NOCODAZOLBEHANDLUNG VON COS-7-ZELLEN 42
4.2.9 KULTIVIERUNG VON FIBROBLASTENZELLLINIEN AUS MURINEM LUNGENGEWEBE
42
4.2.10 ISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG VON PRIMAEREN RPE-ZELLEN 42
4.3 KULTIVIERUNG UND MANIPULATION VON BAKTERIELLEN ZELLEN ( E. COLI) 43
4.3.1 VERWENDETE BAKTERIENSTAEMME 43
4.3.1.1 E. COLI DH5A 43
4.3.1.2 E. COLI BL21 (DE3) 43
4.3.2 ALLGEMEINE WACHSTUMSBEDINGUNGEN 44
4.3.3 GLYZERINSTOCKS 44
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS II
4.3.4 QUANTIFIZIERUNG VON BAKTERIENKULTUREN 44
4.3.5 HERSTELLUNG CHEMISCH KOMPETENTER ZELLEN 44
4.3.6 TRANSFORMATION VON CHEMISCH KOMPETENTEN E. COLI ZELLEN MITTELS
HITZESCHOCK 45 4.3.7 ZELLLYSE MITTELS DER FRENCH PRESS ZELLPRESSE 45
4.4 DNA-BASIERTE MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 45
4.4.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 45
4.4.2 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 46
4.4.2.1 DURCHFUHRUNG EINER PCR 46
4.4.2.2 PCR-BASIERTE AMPLIFIKATION VON GENEN BZW. GENSTUECKEN ZUR
KLONIERUNG 46 4.4.2.3 KOLONIE-PCR ZUR IDENTIFIZIERUNG POSITIVER
TRANSFORMANDEN 47
4.4.2.4 SEMI-QUANTITATIVE REVERSE TRANSKRIPTIONS (RT)-PCR 48
4.4.2.5 PCR ZUR GENOTYPISIERUNG DER TIMP3-KL UND -KO MAUSLINIEN UND
FIBROBLASTEN 48 4.4.2.6 QUANTITATIVE REAL TIME (QRT)-PCR 49
4.4.3 IN VITRO MUTAGENESE 50
4.4.4 AGAROSEGELELEKTROPHORESE ZUR DNA-ANALYSE 51
4.4.5 ISOLIERUNG UND AUFREINIGUNG VON DNA FRAGMENTE AUS AGAROSEGELEN 51
4.4.6 DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 51
4.4.7 SEQUENZSPEZIFISCHER RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA 52
4.4.8 LIGATION 52
4.4.9 DNA-SEQUENZIERUNG UND SEQUENZDATENANALYSE 53
4.4.10 ABLAUF EINER KLONIERUNG 54
4.5 RNA-SPEZIFISCHE METHODEN 54
4.5.1 ISOLIERUNG VON RNA AUS ZELLEN UND GEWEBEN 54
4.5.2 CDNA-SYNTHESE AUS RNA MITTELS REVERSER TRANSKRIPTION 55
4.6 PROTEIN-BASIERTE BIOCHEMISCHE ANALYSEN 55
4.6.1 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH BRADFORD 55
4.6.2 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 55
4.6.3 COOMASSIE-FAERBUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN 57
4.6.4 BLOTTING VON PROTEINEN NACH TOWBIN 57
4.6.5 COOMASSIE-FAERBUNG VON PVDF-MEMBRANEN 57
4.6.6 EXPRESSION UND AUFREINIGUNG REKOMBINANTER GST-FUSIONSPROTEINE 57
4.6.7 EXPRESSION UND AUFREINIGUNG REKOMBINANTER MBP-FUSIONSPROTEINE 58
4.6.8 PROTEIN-PROTEIN BINDUNGSEXPERIMENTE 58
4.6.8.1 GST-PULLDOWN EXPERIMENTE MIT PROTEINEN AUS SAEUGETIERZELLLYSATEN
58 4.6.8.2 GST-PULLDOWN MIT MBP-FUSIONSPROTEINEN 59
4.6.9 MICROTUBULE BINDING PROTEIN SPIN-DOWN ASSAY 59
4.6.10 TUBULIN POLYMERIZATION ASSAY 60
4.6.11 PROTEASOMAKTIVITAETSASSAY 61
4.6.12 ISOLIERUNG UND ENZYMVERDAU VON EZMS AUS FIBROBLASTEN UND
RPE-ZELLEN 62 4.6.13 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON FIBROBLASTEN- BZW.
RPE-EZMS 63
4.7 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 63
4.7.1 HERSTELLUNG POLYKLONALER ANTIKOERPERSEREN 63
4.7.2 AUFREINIGUNG POLYKLONALER ANTIKOERPERSEREN 64
4.7.3 BLOCKEN VON POLYKLONALEN ANTIKOERPERSEREN 64
4.7.4 IMMUNBLOT 65
4.7.5 IMMUNZYTOCHEMISCHE (ICC) FAERBUNGEN VON ZELLEN 65
4.7.6 IMMUNHISTOCHEMISCHE (IHC) FAERBUNGEN VON RETINASCHNITTEN 66
4.7.7 IMMUNPRAEZIPITATION (IP) 67
4.7.8 ENZYM LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 67
4.8 MIKROSKOPIE UND MIKROSKOPISCHE BILDAUFNAHME 68
4.9 BIOINFORMATISCHE ANALYSEN 68
4.10 STATISTISCHE DATENANALYSE 68
5 ERGEBNISSE 69
5.1 PROJEKT 1: AUFKLAERUNG DER ERBLICHEN NETZHAUTDEGENERATION SORSBY
FUNDUSDYSTROPHIE - PATHOMECHANISMUS UND FUNKTION VON TIMP3 69
5.1.1 TIMP3 -GENEXPRESSIONSANALYSEN IN MURINEN FIBROBLASTEN- UND
RPE-KULTUREN 69
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS III
5.1.2 ULTRASTRUKTURELLE UND IMMUNHISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN DER
T1MP3-S156CKNOCKIN-MAEUSE 70
5.1.3 PROTEASOMAKTIVITAETSTESTS MIT MURINEN ZELLEN DER GENOTYPEN TIMP3 /
TIMP3 +/+ , T I M P 3 S M A + UND TIMP3 S,56C/S,56C . 72
5.1.4 DE NOVO EZM-PRODUKTION MURINER ZELLEN DER GENOTYPEN TIMP3 +/+ ,
TIMP3 SI: 6C/+ UND TIMP3 SL56C/SL56C 74
5.1.5 WECHSELWIRKUNGEN VON TIMP3-VARIANTEN MIT EZM-KOMPONENTEN 75
5.1.5.1 EXPERIMENTE MIT ENDOGENEM TIMP3 IN MURINEN FIBROBLASTENKULTUREN
DER GENOTYPEN TIMPJ*, TIMP3 +/+ , TIMP3 SI56C/+ UND TIMP3 S,56AS,56C 75
5.1.5.2 EXPERIMENTE MIT TRANSIENT UEBEREXPRIMIERTEM TIMP3 IN
HEK293-EBNA-ZELLEN 79 5.2 PROJEKT 2: AUFKLAERUNG DER ERBLICHEN
NETZHAUTDEGENERATION RETINITIS PIGMENTOSA (RP28) - PATHOMECHANISMUS UND
FUNKTION VON FAM161A 84
5.2.1 HERSTELLUNG UND AUFREINIGUNG POLYKLONALER ANTIKOERPERSEREN GEGEN
FAM161A 84 5.2.2 LOKALISIERUNG UND EIGENSCHAFTEN VON UEBEREXPRIMIERTEM
FAM161A IN SAEUGETIERZELLEN . 87 5.2.3 PHYSIKALISCHE INTERAKTION VON
FAM161A MIT POLYMERISIERTEN MIKROTUBULI 90 5.2.4
TUBULIN-POLYMERISATIONSSASSAYS 96
5.2.5 HOMOTYPISCHE INTERAKTION VON FAM 161A 97
5.2.6 HETEROTYPISCHE INTERAKTION VON FAM161A UND FAM161B 101
5.2.7 KARTIERUNG VON BEDEUTENDEN AMINOSAEUREN FUER DIE AUSBILDUNG VON
HOMO- UND HETEROTYPISCHEN FAMLOELA-INTERAKTIONEN 104
5.2.8 HEFE-ZWEI-HYBRID-ASSAY ZUR ERMITTLUNG VON
FAMLOELA-INTERAKTIONSPARTNERN 105 6 DISKUSSION 112
6.1 PROJEKT 1: AUFKLAERUNG DER ERBLICHEN NETZHAUTDEGENERATION SORSBY
FUNDUSDYSTROPHIE PATHOMECHANISMUS UND FUNKTION VON TIMP3 112
6.1.1 ANALYSEN ZU VERAENDERUNGEN DER 77/W/?3-GENEXPRESSION 112
6.1.2 ULTRASTRUKTURELLE UND HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN IN S156C-TIMP3
MAEUSEN 112 6.1.3 ERHOEHUNG DER PROTEASOMAKTIVITAET DURCH DIE
S156C-TIMP3-MUTATION 114 6.1.4 S156C-TIMP3-VERMITTELTE ERHOEHUNG DER
EZM-PRODUKTION 116
6.1.5 VERAENDERUNGEN DER EZM-WECHSELWIRKUNG VON MUTIERTEM TIMP3 117
6.1.6 MOLEKULARE MECHANISMEN DER 77MP3-ASSOZIIERTEN SORSBY
FUNDUSDYSTROPHIE 121 6.2 PROJEKT 2: AUFKLAERUNG DER ERBLICHEN
NETZHAUTDEGENERATION RETINITIS PIGMENTOSA (RP28) PATHOMECHANISMUS UND
FUNKTION VON FAMI61A 123
6.2.1 LOKALISIERUNG VON HUMANEM UND MURINEM FAM 161A IM
VERBINDUNGSZILIUM UND DEM BASALKOERPER DER PHOTOREZEPTOREN 123
6.2.2 MIKROTUBULI-LOKALISIERUNG UND EIGENSCHAFTEN VON UEBEREXPRIMIERTEM
FAM 161A 128 6.2.2.1 KO-LOKALISIERUNG VON FAM161A MIT A-, Y- UND
ACETYLIERTEM A-TUBULIN 128 6.2.2.2 PHYSIKALISCHE INTERAKTION VON FAM161A
MIT MIKROTUBULI 131
6.2.2.3 FAM161A-VERMITTELTE ERHOEHUNG DES MIKROTUBULIACETYLIERUNGSLEVELS
135 6.2.3 UPF0564-VERMITTELTE INTERAKTIONEN DER FAM161-PROTEINE 139
6.2.4 HETEROTYPISCHE INTERAKTIONEN VON FAM 161A MIT Y2H-KANDIDATEN 139
6.2.4.1 POTENTIELLE INTERAKTION VON FAM161A MIT DEM KINESINPROTEIN KIF3A
141 6.2.4.2 POTENTIELLE INTERAKTION VON FAM161A MIT DEM KINESINPROTEIN
KIF21B 143 6.2.4.3 POTENTIELLE INTERAKTION VON FAM161A MIT DEM
KINESINPROTEIN KIF1A 144 6.2.4.4 POTENTIELLE INTERAKTION VON FAM161A MIT
DCTN1 145
6.2.4.5 POTENTIELLE INTERAKTION VON FAM161A MIT MAPK8IP3 147
6.2.5 MOLEKULAR MECHANISMEN DER RP28-VERMITTELTEN RETINITIS PIGMENTOSA
148 7 ZUSAMMENFASSUNG 149
8 LITERATURVERZEICHNIS 151
9 ANHANG 163
9.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 163
9.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 166
9.3 TABELLENVERZEICHNIS 168
9.4 PUBLIKATIONEN 169
9.5 TAGUNGSBEITRAEGE 169
9.6 LEBENSLAUF 170
9.7 DANKSAGUNGEN 171
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